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1、研 究 简 报高效毛细管电泳同时拆分外消旋头孢他啶及头孢曲松钠王 荣1 ,2陈立仁31贾正平2谢景文2胡晓丽2李永民11(中国科学院兰州化学物理研究所,兰州730000) 2(兰州军区兰州总医院,兰州730050)摘 要 用毛细管电泳 2环糊精( 2CD)添加剂法同时拆分外消旋头孢他啶及头孢曲松钠,主要考察了影响分离和测定的因素:( 2CD浓度,背景电解质的pH值,分离电压和毛细管的柱温。通过优化得到了毛细管电泳手性分离头孢他啶及头孢曲松钠对映体的实验方法,在280 nm处进行紫外检测,分离温度为25,压力进样6s ,分离电压为28 kV ,背景缓冲液含50 mmolL磷酸二氢钠、0. 04
2、mmolL 2环糊精( 2CD)、3. 0 mmolL (三羟甲基)氨基甲烷(Tirs) ,pH为7.15的条件下,头孢他啶及头孢曲松钠同时能达到基线分离。对其拆分机理进行了探讨。关键词 毛细管电泳,手性拆分,头孢他啶,头孢曲松钠2001210223收稿;2002204228接受1 引 言手性药物对映体的分离分析在药物质量控制,对映体的生物活性测定和药理作用等方面有着非常重要的意义1。一般地,毛细管手性拆分通过添加手性选择剂(如冠醚、 胆盐、 多肽和环糊精及其衍生物等)25后,手性对映体药物与手性选择剂相互作用不同而达到分离。头孢菌素具有抗菌作用强、 耐青霉素酶、 临床疗效高、 毒性低、 过敏
3、反应较青霉素类少见,组织穿透力强及消除半衰期长(79 h)等优点,近年来作为外科术后抗感染的预防性抗生素日益受到关注6 ,7。同时,临床及药理实验表明不同厂家生产的头孢他啶和头孢曲松钠消旋体药品具有不同的临床疗效和抗菌作用8。因此,拆分头孢他啶和头孢曲松钠对映体可为深入研究不同厂家、 不同批次药品具有不同的疗效和抗菌作用,并为控制药品的质量提供理论依据。对外消旋抗菌素药品头孢他啶和头孢曲松钠进行拆分研究未见文献报道,本文用毛细管电泳在的磷酸盐介质中添加 2CD同时拆分了头孢他啶和头孢曲松钠两种药物对映体,并对其拆分机理进行了初步探讨。2 实验部分2.1 仪器及试剂Beckman PACE500
4、0型毛细管电泳仪,PACE固定波长紫外检测器,熔融石英毛细管(75 cm5m ,i. d. ) (美国Beckman公司)。头孢他啶,头孢曲松钠标准对照品(中国药品生物制品鉴定所) , 2环糊精(Sigma公司) ,其余试剂为分析纯,二次重蒸馏水。2.2 实验方法缓冲液使用前用0.45m滤膜过滤,超声波脱气。两次分析之间用0. 1 molL NaOH冲洗毛细管3min ,超纯水3 min ,缓冲液5.6 min。3 结果与讨论3.1 电泳条件对分离的影响3.1.1 2CD的浓度的影响 Martin和Nishi9认为,在对映体分离中,手性选择剂总存在一个最佳浓第30卷2002年9月分析化学(FE
5、NXI HUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第9期10701073度,这一浓度与包络物的结合常数有关,结合常数愈大,最佳浓度愈低,反之则愈高。当 2CD浓度太低 或太高时,都会导致分离度的下降, 2CD的影响结果见图1。由图看出,当 2CD不存在时,两种药物得 不到手性分离;在00.4 mmolL范围内,随着 2CD浓度的增加,分离度也增加,结果表明: 2CD浓度为0. 04 mmolL时,达到基线分离(Rsa= 4.15 ,Rsb= 5.08) ,而分离时间也较短(约8 min) ,因此,在本实验中 2CD浓度确定为0.04
6、mmolL。图1 2CD的浓度对头孢他啶及头孢曲松钠有效淌度(A)和分离度(B)的影响Fig.1 Effect of concentration of 2cyclodextrin ( 2CD) on the electopilores mobility (A) , resoltion (B) ofceftazidime (a) and cefriaxone Na(b)1 ,2.头孢他啶(ceftazidime) ; 3 ,4.头孢曲松钠(cefriazone Na)。3.1.2 pH的影响 考察了酸度对两种药物对映体分离的影响,发现pH值在4. 009. 00之间,存在一 个最佳分离度。两种药
7、物对映体在pH为7.007.50范围内得到很好分离,因此,考察分离度及分离时间确定最佳pH值为7.15。3.1.3 电压的影响 分离度(Rs)正比于操作电压(V)的0. 5次方10,在电压升高的同时,焦耳热也相应增加,引起分离度下降。因此,在一定范围内分离度随电压增高而增大,图2表明实验中Rs和有效淌度与电压的函数关系。在药物对映体得到完全分离的情况下,考虑到分离度及出峰时间,分离电压选择为28 kV。图2 电压对头孢他啶及头孢曲松钠有效淌度(A)和分离度(B)的影响Fig.2 Effect of voltage on the electophoresis mobility (A) and (
8、B) of ceftazidime (a) and cefriaxone Na(b)电泳条件(electrophoretic) :50 mmolL NaH2PO4,0.04 molL 2CD。1 ,2.头孢他啶(ceftazidime) ; 3 ,4.头孢曲松钠(cefriazone Na)。3.1.4 柱温对EOF的影响 柱温升高,溶液的粘度降低,导致EOF增大。本实验结果表明在28 kV电 场强度下,温度在2050 范围内,对分离度影响不大。故选择25 作为分离柱温。3.2 拆分头孢他啶和头孢曲松钠色谱图综上所述最佳的实验条件为紫外检测波长:280 nm ,分离温度:25,压力进样6 s
9、,分离电压:28 kV , 背景缓冲液:50 mmolL磷酸二氢钠、0.04 mmolL 2CD、3.0 mmolL Tirs ,pH 7.15。两种对映体药物各峰 均得到基线分离,分离在8 min内完成,其典型色谱图见图3。由图可以看出,1 ,22头孢他啶对映体在3 ,1701第9期王 荣等:高效毛细管电泳同时拆分外消旋头孢他啶及头孢曲松钠 图3 两种对映体药物手性分离Fig.3 Chiral separation of two durgs enantionmce条件(conditions) : 50 mmolL磷酸盐(phosphate) + 0. 04mmolL 2CD + 3 mmol
10、L三羟甲基氨基甲烷(Tris)。电压(voltage) :28 kV , pH = 7. 5。1 ,2.头孢他啶(ceftazidime) ;3 ,4.头孢曲松钠(cefriazone Na)。42头孢曲松钠对映体之前出峰。3.3 拆分机理探讨 2CD为7个D2( + )2吡喃葡萄糖组成的环状低聚 糖,具有疏水性内腔和亲水性外壳,可与一些有机化合 物形成主2客体包合物11 ,12,对外消旋药物头孢他啶和头孢曲松钠的包合物经搭模型后,可认为头孢他啶和头 孢曲松钠前体分子中疏水基团由宽口端进入,与 2CD 形成包络物,同时形成分子间诱导力、 色散力和氢键,其 中氢键对拆分起主要作用。头孢他啶和头孢
11、曲松钠对 映体的D和L两种构型在氢键作用方面表现有所差异。(1)头孢他啶L型的- NOC(CH3)2COOH基团上氧原子上的孤对电子可以与 2CD上的O2H键处于同一直线空间取向稳定,而且 2NH中氮原子与 2OH处于相同的位 置,形成稳定的氢键,能量较低。而D型若要形成氢键, 则势必会引起CNH键和NOC(CH3)2COOH扭曲,为此需克服较大的能垒,不利于氢键的形成。若与邻位 上的羟基发生氢键作用,从空间效应来看,受邻位同侧其它基因的空间排斥,形成氢键能力也较弱。因 此,D型较L型氢键作用弱些。(2)头孢曲松钠L型NOCH3基团上氧原子上的孤对电子可以与 2CD上OH键处于空间取向稳定,能
12、形成稳定的氢键,而且 2NH中氮原子与 2OH处于相同的位置,形成 稳定的氢键能量较低。而D型若要形成氢键,则会引起CNH键和NOCH3扭曲和变小,将不利于氢键的形成。若其它基团中孤对电子的原子与邻位上的羟基发生氢键作用,受邻位同侧其它基团的 空间排斥,故形成氢键能力较弱。同时,碳上的氢原子位于腔内,形成氢键将受空间位阻排斥,最终导致D型较L型氢键作用弱。因此,L型较D型易形成稳定的氢键,即L型包络物较D型包络物更稳定。 从头孢他啶的结构来看,其结构中含有32甲基吡啶嗡内盐与 2CD形成带正电荷包络物朝负极(出 样端)迁移,与电渗流方向一致,包络物朝负极迁移趋势愈大,从而出峰时间愈短。同时,头
13、孢他啶和头 孢曲松钠的疏水基团相比较,前者的疏水性较后者的疏水性弱。从形成氢键的结果来看,头孢他啶较头 孢曲松钠的空间位阻大,形成稳定氢键的能量较高,故被拆分的两种药物对映体,头孢他啶较头孢曲松钠先出峰。由此可推断图3中电泳所标出的1、2、3、4峰与其相对应的手性化合物为D2头孢他啶,L2头 孢他啶,D2头孢曲松钠和L2头孢曲松钠。由于无相应单一标准品,图3中色谱峰准确的归属有待于进 一步证实。References1 Takashi A.J.Chromatogr B,1998, 717:2953112 Martin G S,Gerald G.J.Chromatogr.A,1995, 709:8
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