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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 和 Caspase3 在结直肠癌组织中的表达及其相关性作者：李日恒,程树杰作者单位：河北大学附属医院，河北 保定 071000【摘要】目的 确定 Livin 蛋白和 Caspase3 蛋白在结直肠癌组织细胞中的定位，并分析其与临床病理特征的相关性。方法 应用免疫组化技术检测 Livin 蛋白和 Caspase 3 蛋白。结果 结直肠癌组织 Livin 高表达，同时 Caspase 3 低表达;正常大肠组织及结肠腺瘤息肉中无 Livin 表达，而 Caspase 3 高表达。Livin 蛋白定位于细胞质中;Caspase 3 蛋白绝大多数定位于细胞质，极
2、少数定位于细胞核中。结论 Livin 基因激活与结直肠癌发生、发展相关，促凋亡基因Caspase 3 与凋亡抑制基因 Livin 共同调节参与了结直肠癌的发病机制。Livin 蛋白的表达与结直肠癌分化程度明显相关，分化越低，表达越高;与结直肠癌的临床分期、淋巴转移无关。【关键词】 结直肠癌;细胞凋亡;凋亡抑制蛋白;Livin;Caspase 3应用免疫组化法对 60 例结直肠癌组织、30 例结直肠腺瘤、息肉组织和 10 例正常结直肠组织中 Livin 蛋白和 Caspase 3 蛋白的表达进行检测，了解 Livin 蛋白和 Caspase 3 蛋白在这些组织中的表达情况，探讨 Livin 和
3、Caspase 3 在结直肠癌组织中的表达及其相关性，旨在为结直肠癌的诊断及治疗寻求一个新的途径，并提供KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 资料与方法1.1 临床资料收集河北大学附属医院 20042008 年结直肠癌手术标本80 例，全部标本经 10%甲醛固定，石蜡包埋。经重新复阅切片，对诊断明确、资料完整的 60 例结直肠癌进行研究。所有病例术前均未行放疗及化疗。组织病理学分类：黏液癌10 例包括黏液腺癌、印戒细胞癌; 非黏液癌50 例包括乳头状腺癌、管状腺癌及未分化癌。高分化 15 例，中分化 29 例，低分化 16 例;结直肠癌临床病理分期根据 Dukes 分期标准，A 期 16
4、例，B 期 18 例，C 期 17 例，D 期 9例;有淋巴结转移 14 例，无淋巴结转移 46 例。30 例纤维结肠镜下手术切除后经病理检查证实的结直肠腺瘤、息肉组织标本和 10 例结肠冗长症等疾病手术切除标本中的正常结直肠组织标本。患者年龄3486 岁，平均 62 岁。1.2 方法标本经甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度为 3 m。采用 SP法，一抗兔抗人 Livin 多克隆抗体(美国 ADI 公司生产)，兔抗人Caspase 3 多克隆抗体( 购于武汉博士德生物工程有限公司) 。免疫组化染色即用型快速免疫组化 MaxVisionTM 试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。DAB 显色试剂盒购自福
5、州迈新生物技术有限公司。PBS 替代一抗为阴性对照。结果判定： Livin、Caspase 3 阳性染色均为棕黄色颗粒，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1%25% ，( )为阳性细胞数在 25%50%，( )为阳性细胞数50%。进行统计学分析时，+ 均作为阳性表达。1.3 统计学方法数据采用 SPSS12.0 统计软件进行统计学分析，率的比较采用 2 检验。2 结 果2.1 Livin 蛋白表达情况10 例正常结直肠组织及 30 例结直肠腺瘤、息肉组织中均未发现黄色或棕黄色染色颗粒。60 例结直肠癌组织中有 42 例 Livin蛋白表达阳性，阳性率为 70%。细胞质中发现棕黄色染色颗
6、粒，表明 Livin 蛋白在结直肠癌组织中定位在细胞质中。结直肠癌组织中Livin 蛋白高表达与正常结直肠组织、结直肠腺瘤、息肉的表达差异显著(P0.05)，而与肿瘤分化程度明显相关(P0.01)，见表 1。2.3 Livin 蛋白与 Caspase 3 蛋白阳性表达的相关性Livin 蛋白在结直肠癌组织、结直肠腺瘤、息肉、正常大肠表达阳性率分别为 70%、0、0;Caspase 3 蛋白在结直肠癌组织、结直肠腺瘤、息肉、正常大肠表达阳性率分别为 45%、60% 、80%，二者呈反向关系。3 讨 论结直肠癌是一种严重危害人类健康的消化系恶性肿瘤。近年来，结直肠癌的基础和临床研究已取得很大进步，
7、但病因学和发病机制尚未完全阐明。Livin 是 2000 年发现的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成员，在胚胎组织中存在，在胎儿发育过程中多种组织高表达，在正常成人的大多数终末组织中(除胎盘)低表达或不表达，正常大肠组织中无Livin 基因的表达14 。Livin 的细胞定位各方报道不一。Ka 等5以免疫组化法对不同时期的胎盘、滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系染色，阳性显色仅定位于胞核。Kasof 等2用含有 Livin 基因的质粒转染 HeLa 细胞并予相应抗体检测其表达产物，发现细胞核及胞浆内同时呈纤维细丝样染色，与 survivin 细胞内分布相似。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 等6
8、检测肺癌，免疫组织化学染色显示肺癌细胞的 Livin蛋白在胞浆和胞核均有显色。细胞凋亡是维持内环境稳定的重要机制之一。Caspase 是执行凋亡的主要酶类，其中 Caspase 3 是 Caspase 中的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子，广泛表达于正常人体组织及多种肿瘤组织中，可作用于多种底物，其底物改变与细胞凋亡表型密切相关，在 Caspase 酶系级联反应中发挥重要作用。Livin 可以通过抑制 Caspase 途径达到抗细胞凋亡调节作用，Livin 可与介导细胞凋亡的下游效应 Caspase，即激活形式的Caspase 3 和 Caspase 7 结合，并抑制其活性。Livin 还
9、可与未加工的或断裂形式的 Caspase 9 结合，可抑制由 Apaf 1，细胞色素C 及 dATP 诱导的 Caspase 9 激活作用。Livin 与 Caspase 的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，这有赖于其 BIR 结构域的完整，BIR 结构域内单个氨基酸的突变即可导致 Livin 与 Caspase 的结合作用及 Livin 抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失。随着对多种肿瘤中 Livin 的研究，显示 Livin 在很多肿瘤组织中有过表达，如在黑色素瘤、人子宫颈癌 Hela 细胞、人肝癌细胞、非小细胞肺癌细胞、白血病 T 细胞、鼻咽癌上均有显著性过表达现象712 ，这些研
10、究结果提示，Livin 的过表达可能是维持肿瘤细胞在体内生长的重要因素。最近研究还发现在消化道肿瘤中，如胃癌、胰腺癌及肝癌中均见 Livin 呈过度表达。Yagihashi 等13发现在胃肠癌患者中，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 抗体的表达率为 47%且与 Survivin 抗体的表达无相关性。Livin基因是某些肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。然而，Livin 基因在结直肠癌发病机制中的作用、恶性生物学行为(侵袭和转移) 的表达，以及是否可作为早期诊断及治疗的靶点鲜见报道。本研究采用免疫组织化学染色方法检测，确定了 Livin 蛋白和 Caspase 3 蛋白在细胞中的定位，Livin
11、 蛋白定位于细胞质中;Caspase 3 蛋白绝大多数定位于细胞质，极少数定位于细胞核中。实验发现结直肠癌组织 Livin 基因高表达，同时 Caspase 3 基因低表达;在正常大肠组织及结肠腺瘤、息肉中 Livin 基因无表达，而Caspase 3 高表达。说明促凋亡基因 Caspase 3 与凋亡抑制基因Livin 共同失调节参与了结直肠癌的发病机制。本实验进一步印证了Livin 蛋白的表达与结直肠癌组织的分化程度有关，分化越低，表达越高;与结直肠癌患者的年龄、临床分期、淋巴转移无关。因此可以认为肿瘤正是通过对 Livin 的过量表达，上调它们在有丝分裂中的抗凋亡作用，从而保持肿瘤细胞的
12、增殖和生长，故 Livin 与结直肠癌的演进有关。Livin 蛋白表达与结直肠癌的分化程度显著相关，几乎所有的低分化癌均可检测到 Livin 的过表达，而 Caspases 3 却仅仅只有 2 例呈阳性表达，表明其抗凋亡作用的机制是通过 Caspase 途径实现的14 。Caspase 3 在结直肠正常黏膜和结直肠癌中的表达率依次减少，提示 Caspase 3 表达降低与结直肠癌的形成和进展有关。Caspase 3 表达率在结直肠癌高、中分化组明显高于低分化组，表明 Caspase 3 表达与结直肠癌分化程度KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Caspase 3 表达阳性，可能提示癌细胞
13、分化程度高，细胞凋亡调控机制障碍程度轻，癌细胞增殖比较弱。综上结果表明，Livin 和 Caspase 3 在结直肠癌的发生和演化中起着重要的作用。Livin 可能直接作用于 Caspase 3 并抑制其活性，阻断细胞的凋亡过程，从而促进了结直肠癌的癌细胞不断增殖。Livin 作为一个新的凋亡抑制基因，它的激活与结直肠癌发生、发展相关，是结直肠癌诊断和治疗的潜在靶点。【参考文献】1 Ashhab Y，Alian A，Polliack A,et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different
14、 different biological properties and tissue distribution patternJ .FEBS Lett，2001;495(1 2):56.2 Kasof GM ，Gomes BC.Livin ，a novel inhibitor of apoptosis protein family memberJ.J Biol Chem ，2001;276(5):3238.3 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT,et al.ML IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is prefer
15、entially expressed in human melanomasJ.Curr Biol ，2000;10(11):1359.4 Lin JH，Deng G，Huang Q,et al.KIAP,a novel member of the inhibitor of apoptosis protein familyJ.Biochem Biophys Res Commun， 2000;279(3):820.5 Ka H，Hunt JS.Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas J.Am J KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Hariu H，Hirohashi Y，Torigoe T,et al.Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein f
