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1、硕士学位论文论文题目年龄相关生物标志物的联合检测推测生物学年龄的价值及其临床应用研究研 究 生 姓 名赵春楠指导教师姓名史进方专 业 名 称临床检验诊断学研 究 方 向临床免疫学与微生物学论文提交日期2014 年 3 月年龄相关生物标志物的联合检测推测生物学年龄的价值及其临床应用研究中文摘要I年龄相关生物标志物的联合检测推测生物学年龄的价值及其临床应用研究中文摘要目的目的 衰老是生命现象的一个复杂的过程，在衰老的过程中必然存在某些生物标志物的变化，本文旨在筛选出与年龄相关的生物标志物，即衰老生物标志物，通过其联合检测对生物学年龄进行判别分析， 利用多元线性逐步回归的方法建立生物学年龄的回归方程
2、， 并观察其预测价值，同时探讨年龄相关性生物标志物与衰老相关性疾病(2 型糖尿病及动脉粥样硬化)的关系。方法方法 收集苏州大学附属第一人民医院体检科正常健康人血浆 180 例，内分泌科2 型糖尿病患者血浆 40 例，心内科动脉粥样硬化患者血浆 40 例。第一部分 利用 ELISA 方法检测 180 例正常健康人血浆中生物标志物（TIMP-1、IGF-1、IL-2、IL-6、CRP、TNF-、Insulin）在、四组中的表达情况，及其与年龄的相关性。 利用筛选出的年龄相关性生物标志物联合检测对生物学年龄进行判别分析， 利用多元线性逐步回归的方法建立生物学年龄的回归方程，并观察其预测的价值。第二部
3、分 利用 ELISA 方法检测两种衰老相关性疾病（2 型糖尿病及动脉粥样硬化） 患者血浆中年龄相关性生物标志物的表达水平，探讨年龄相关性生物标志物与衰老相关性疾病的关系。结果结果 第一部分（1）TIMP-1、IGF-1、IL-2、IL-6、CRP、TNF-、Insulin 在四组间有显著性差异（P70=-22.925+135.232*TIMP-1+0.046*IGF-1+0.861*IL-2+1.506*IL-6-0.073*CRP（4）通过多元线性逐步回归分析得到了预测生物学年龄的回归方程：Y=61.313+147.643*TIMP-1-0.15*IGF-1-1.639*IL-2+1.641
4、*IL-6(R2=0.594，F=38.923)。并通过残差分析，判断了得到的回归模型效果较好，是合理的。第二部分 （1）血浆中 TIMP-1、IL-2、IL-6、CRP 在 2 型糖尿病及动脉粥样硬化患者中均较正常对照升高，P70=-22.925+135.232*TIMP-1+0.046*IGF-1+0.861*IL-2+1.506*IL-6-0.073*CRP(4)Stepwiseregressionanalysisofbiologicalageregressionequationis:Y=61.313+147.643*TIMP-1-0.15*IGF-1-1.639*IL-2+1.641*
5、IL-6 (R2=0.594,F=38.923).And through residual analysis, regression model to determine the effect has beenbetter, is reasonable.Second part (1) Plasma TIMP-1, IL-2, IL-6, CRP elevated compared with normalcontrols in type 2 diabetes and atherosclerosis patients,P70 岁男 20 例、 女 10 例， 平均年龄 50.7217.49岁，具体
6、基本资料（见表 1） 。年龄相关生物标志物的联合检测推测生物学年龄的价值及其临床应用研究第一部分51.21.21.21.2 目标生物标志物的选取目标生物标志物的选取本实验检测的目标生物标志物主要经查阅相关参考文献而确定。 这些生物标志物包括：金属基质蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1） 、胰岛素样生长因子-1（IGF-1） 、白细胞介素-2 （IL-2） 、 白细胞介素-6 （IL-6） 、 C 反应蛋白 （CRP） 、 肿瘤坏死因子- （TNF-）、胰岛素（Insulin） 。1.31.31.31.3 主要仪器和试剂主要仪器和试剂1.3.1 主要仪器Eppendof 高速冷冻离心机（德国 e
7、ppendof 公司） ，-80低温冰箱，-20冰箱，Thermo 超净工作台（上海瑞仰） ，PW-960 Plus 多功能全自动洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司） ，Bio-Rad 680 酶标仪（美国 Bio-Rad 公司） ，希森美康五分类血球仪（日本希森美康公司） ，AU5800 全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司） ，微量加样枪（德国 eppendof 公司） ，立式高压灭菌锅等。1.3.2 主要试剂金属基质蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1） 、白细胞介素-2（IL-2） 、白细胞介素（IL-6） 、C 反应蛋白（CRP） 、肿瘤坏死因子-（TNF-） 、胰岛素（Insuli
8、n）ELISA试剂盒（上海吉泰生物工程有限公司） 。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）ELISA 试剂盒（RD 公司） ，灭菌生理盐水。1.41.41.41.4 实验步骤实验步骤1.4.1 血浆标本的收集：健康体检者外周血 5mL， EDTAk2 抗凝， 收集的外周血标本于 2 h 内 1500r/min，离心 20min，收集血浆，分装后-80冰箱储存备用。1.4.2 血浆标本的检测：1.4.2.1 金属基质蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）按下列步骤检测：（1） 提前准备好样本（用试剂稀释液按 1:200 稀释） 、标准品和生物素化抗体工作液 （用试剂稀释液按 1： 100 稀释浓缩生物
9、素化抗体配成生物素化抗体工作液）（2） 将样本和不同浓度标准品（0 对照加试剂稀释液）加入相应孔中（100ul/孔），随后在样本和标准品孔中加入 50ul 生物素化抗体工作液，用封胶纸封住反应年龄相关生物标志物的联合检测推测生物学年龄的价值及其临床应用研究第一部分6孔，室温（20-25）孵育 120min。（3） 提前 30min 制备酶结合物工作液（用试剂稀释液按 1：100 稀释浓缩酶结合物配成酶结合物工作液） ，室温避光放置。（4） 洗板 4 次，除空白孔外加入酶结合物工作液（100ul/孔） ，用封板胶纸封住反应孔，室温（20-25） ，避光孵育 60min。（5） 洗板 4 次，加入
10、显色底物（包括空白）100ul/孔，室温（20-25）避光孵育10-15min。（6） 加入终止液（包括空白）100ul/孔，混匀后即刻测量 OD450值（10min 内） 。1.4.2.2 胰岛素样生长因子-1（IGF-1）按下列步骤检测：标本的预处理：1在每个 EP 管中加 190ul Pretreatment A，加入 10ul 血浆标本，混匀，室温10min。在每个 EP 管中加 100ul Pretreatment B，加入上述血浆 25ul，混匀，待测。（1） 每孔加入 150ulAssay Diluent RD1-53，将处理好的样本和不同浓度标准品（标准品用校准稀释液 RD5-
11、22 稀释，0 对照加入校准稀释液 RD5-22）加入相应孔中（50ul/孔） ，用封板胶纸封住反应孔，2-8孵育 2h。（2） 洗板 4 次，加 200ul 冷的 IGF-1 Conjugate 到每孔，2-8孵育 1h。（3） 洗板 4 次，加 200ul Substrate Solution 到每孔，避光室温孵育 30min。（4） 加 50ul 终止液于各孔，30min 内读板。1.4.2.3 白细胞介素（IL-6） 、白细胞介素-2（IL-2） 、C 反应蛋白（CRP） 、TNF-、按下列步骤检测：（1） 将标本和不同浓度标准品（0 对照加试剂稀释液）加入相应孔中（100ul/孔），
12、用封胶纸封住反应孔，37孵育 90min。（2） 提前 30min 制备生物素化抗体工作液（用试剂稀释液按 1：100 稀释浓缩生物素化抗体配成生物素化抗体工作液） 。（3） 洗板 5 次，除空白外，加入（100ul/孔）生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔，37孵育 60min。（4） 提前 30min 制备酶结合物工作液，室温避光放置。年龄相关生物标志物的联合检测推测生物学年龄的价值及其临床应用研究第一部分7（5） 洗板 5 次，除空白孔外，加入酶结合物工作液（100ul/孔） ，用封板胶纸封住反应孔，37避光孵育 30min。（6） 洗板 5 次，加入显色底物（包括空白）100ul/
13、孔，37避光孵育 15min。（7） 加入终止液（包括空白）100ul/孔，混匀后即刻测量 OD450值（10min 内） 。1.4.2.4 胰岛素（Insulin）按下列步骤检测：（1） 提前准备好样本，标准品和生物素化抗体工作液（用试剂稀释液按 1:100 稀释浓缩生物素化抗体） 。（2） 将样本和不同浓度标准品（0 对照加试剂稀释液）加入相应孔中（50ul/孔） ，随后在样本和标准品孔中加入 50ul 生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应板，室温（20-25） ，孵育 60min。（3）提前 30min 准备酶结合工作液（用试剂稀释液按 1:100 稀释浓缩酶结合物），室温避光放置。（
14、4） 洗板 5 次，除空白孔外加入酶结合物工作液（100ul/孔） ，用封板胶纸封住反应孔，室温（20-25） ，避光孵育 60min。（5） 洗板 5 次，加入显色底物（包括空白）100ul/孔，室温（20-25）避光孵育15min。（6） 加入终止液（包括空白）100ul/孔，混匀后即刻测量 OD450 值（10min 内） 。1.51.51.51.5 统计方法统计方法全部数据采用 SPASS 17.0 统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），年龄相关生物标志物的筛选采用 Pearson 相关分析，生物学年龄的预测采用判别分析及多重线性逐步回归分析,
15、 回归方程合理性检验采用残差分析，生理年龄与生物学年龄的相关性分析采用 Pearson 相关分析，P7029/1176.155.035.861.351.920.714.560.41续表续表 1-11-11-11-1年龄组肌酐(44.2-104.0umol/L)尿酸(150.0-420.0umol/L)血糖(3.90-6.10mmol/L)总胆固醇(2.90-5.72mmol/L)总甘油三酯(0.35-2.30mmol/L)20-3066.8813.15268.5081.834.890.604.130.600.820.4231-4066.2512.63288.5086.094.730.314.4
16、00.601.160.6941-5070.9512.76288.5083.605.030.864.740.641.691.3851-6074.4212.37304.1081.825.310.964.760.891.440.8561-7078.5022.21351.0095.155.751.794.751.021.590.737077.7119.15329.9084.845.460.894.540.781.461.212.22.22.22.2 各指标组间方差分析结果各指标组间方差分析结果根据疾病发生和康复效能将整体实验对象分成不同的组别21：组 健康期 44岁，组 疾病多发期 45-69 岁，组 疾病高发期 70-84 岁，组 生命危险期 85岁。经单因素方差分析可知：生物标志物在各组之间有显著性差异（P85 岁F值P值TIMP-1(pg/ml)IGF-1(ng/ml)IL-6(pg/ml)IL-2(pg/ml)CRP(ng/ml)TNF-
