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1、基于介孔二氧化硅双模态多功能探针的制备及成像研究S y n t h e s 。Im a g n go fMu。t-functISa n d nv iv om a gIUIIT U n c 。Io n a 。Iln gO TtM e s o p o r o u sSiIic aN a n o p r o b eWit hN e a r l 。in f r a r e da n dM a g n e tiCR e s o n a n c e学位申请人删导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院枷教授2 0 13 年5 月7 日刖、| 、I究帮童博士学位论文基于介孔二氧化硅双模态多功能探针的制备及实验
2、研究博士研究生：朱飞鹏指导老师：卢光明教授摘要研究背景和意义胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，其发病率高，预后差。胶质瘤中约8 0 的病变为恶性，主要包括胶质母细胞瘤和间变性胶质瘤。虽然近年来出现了以手术为主，联合放疗、化疗的综合治疗方案，和一些针对肿瘤血管新生的靶向治疗药物，但恶性胶质瘤患者的5 年生存率仍然没有得到显著改善。部分胶质瘤患者在接受治疗后还出现肿瘤复发进展、恶性程度增高的现象。这主要是因为恶性胶质瘤特别是胶质母细胞瘤呈浸润性生长，肿瘤细胞沿神经纤维和毛细血管侵犯生长，与正常脑组织、神经纤维和血管分界不清，手术难以彻底切除。此外，手术和放疗区域大量增生的神经胶质，也给残留和
3、复发肿瘤组织的检测带来了很大困难。因此对胶质瘤进行非侵入性的早期诊断、准确定位和边界显示，并区分正常脑组织、肿瘤和增生的神经胶质，对治疗和预后具有十分重要的意义。目前胶质瘤的诊断主要依靠影像学手段，特别是磁共振和核素扫描。但磁共振和核素检查对体积较小、血脑屏障破坏较轻的肿瘤检测的敏感度和特异度较低。如何在提供详细解剖学细节的基础上实现对胶质瘤高敏感度、高特异度的非侵入性的显像，成为全世界范围内研究人员和医务工作者面临的巨大挑战。随着科技的进步和生命科学的发展，在最近几十年出现了以能够在活体状态下利用影像学方法在细胞和分子水平上研究生物体内生化进程为目标的摘要新兴学科分子影像学( M o l e
4、 c u l a ri m a g i n g ，M I ) 。M I 的最显著特点是借助各种分子探针，利用磁共振( M a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g e ，M R I ) 、光学、核素和超声等影像学技术，实现对单个细胞、乃至单个分子的非侵入性显像。作为生命科学研究的有力工具，分子影像自诞生之初就广泛应用于重大疾病研究、药物研发、干细胞治疗( 示踪) 等生物医学研究领域，并发挥着越来越重要的作用。而作为M I 最为关键的环节，分子成像探针的研发也一直处于分子影像研究的最前沿，并取得了令人瞩目的成就。然而，随着生命科学研究的不断深入，单纯依靠一种成像
5、方法已经不能满足人们对M I 成像精准度的要求。因此，将多种成像模式的分子探针进行融合，开发能同时满足多种成像模式需求的分子探针成为了广大分子影像研究工作者关注的焦点。在M I 传统的成像方法中，M R I 和光学成像以其无创、实时、无X 线电离辐射和可重复性高等优势一直是国内外学者研究的热点，也是最具发展前景的成像手段。M R 和光学探针的融合，不仅可以提高探针的敏感度，而且能够提供靶器官详细的软组织解剖细节，满足早期、动态、实时、无创和精准成像的要求。在本项目中我们针对当前胶质瘤研究的热点问题，利用具备良好生物相容性的介孔二氧化硅( M e s o p o r o u ss i l i c
6、 an a n o p a r t i c l e s ，M S N s ) 材料、有机近红外荧光染料( I R - 8 0 8 ) 和磁共振含钆对比剂( G d - D n A ) 构建具有近红外( N e mi n f a r e d ，N I R ) 光学和磁共振双模态成像功能的分子探针，并建立人胶质母细胞瘤皮下肿瘤模型，探讨所构建分子探针的稳定性、靶向成像的效果和生物相容性。以期通过构建的双模态成像分子探针，为胶质瘤的早期诊断提供新的技术支持。研究目的一、探讨近红外花菁类染料I R - 8 0 8 对胶质瘤、乳腺癌等恶性肿瘤靶向成像的可行性，并对I R - 8 0 8 的生物相容性进行
7、研究，为后期双模态成像探针的构建I I博士学位论文寻找合适的N I R 光学成像探针：二、构建具有良好单分散性、高比表面、规N ：Y L 道结构和生物相容性的介孔二氧化硅纳米材料，为进一步构建具有M R I 和N I R 双模态成像的分子探针提供生物纳米材料载体；三、构建具有良好水溶性、生物相容性的M R I 和N I R 多功能双模态成像探针，并检验其在体外和活体组织内成像的可行性；四、探讨所构建的多功能双模态探针对人胶质母细胞瘤( U 8 7 M G ) 裸鼠模型成像的可行性及其应用价值。研究方法j 内容和结果一、近红外花菁类染料I R - 8 0 8 对胶质瘤的靶向性光学成像研究1 、肿
8、瘤细胞培养和标记C 6 细胞的培养采用含胎牛血清( 1 5 ) 、马血清( 2 5 ) 和1 双抗( 1 0 0 U m l 青霉素和1 0 0 m g m l 链霉素) 的F 1 2I O i g h n S 培养基，人胶质母细胞瘤细胞U 8 7 M G 和人乳腺癌细胞M D A M B 2 3 1 的培养采用含1 0 胎牛血清和1 双抗的高糖D M E M 培养基；所有细胞均在细胞培养箱内以3 7 摄氏度( o C ) 、5 C 0 2 及饱和湿度条件下的连续培养传代，所有细胞均贴壁生长。2 4 孔板每孔中加入l 山I R - 8 0 8 溶液( 1 0 r a M ) 在3 7 0 C
9、细胞培养箱内孵育1 0 1 5r a i n 。多聚甲醛固定后，进行D A P I 染色。荧光倒置相差显微镜观察显示：I R - 8 0 8 在体外显示出对大鼠胶质瘤C 6 细胞、人胶质母细胞U 8 7 一M G 均具有良好的靶向性；荧光显微镜照片显示，I R - 8 0 8 均匀分布于C 6 、U 8 7 M G 和M D A M B 一2 3 1 细胞体内，胞核未见近红外荧光染色；而人胚肾细胞H E K2 9 3 T 胞体呈微弱近红外荧光。2 、I R - 8 0 8 的细胞毒性试验人胚肾细胞H E K2 9 3 T 采用含1 0 胎牛血清和1 双抗的高糖D M E MI I I摘要培养基
10、；在细胞培养箱内以3 7 0 C 、5 C 0 2 及饱和湿度条件下的连续培养传代，H E K2 9 3 T 细胞贴壁生长。M T T 法计算I R - 8 0 8 的细胞毒性表明正常剂量浓度( 2 0 1 t m o l L ) 的I R 8 0 8 溶液在共孵育4 8 h 时对人胚肾细胞H E K2 9 3 T 的生长无明显影响，2 倍于正常浓度的I R 8 0 8 溶液在4 8 h 后明显降低了H E K2 9 3 T 细胞的增殖。3 、近红外花菁类染料I R - 8 0 8 靶向M D A - M B 2 3 1 乳腺癌和C 6 胶质瘤的活体实验当裸鼠皮下肿瘤直径达约0 5 c m 时
11、，经尾静脉注射2 0 0 1 dI R - 8 0 8 溶液( 0 0 5 r a M ) 。2 4 h 后进行光学成像检测，激发波长为7 7 8 n m ，发射光波长为8 0 8 n m 。乳腺癌肿瘤部位有较明显的近红外荧光信号，且具有良好的背景噪声比。将肿瘤组织完整切除后，体外近红外荧光成像也显示出较高的近红外信号。B A L B C 裸小鼠胶质瘤原位模型活体近红外荧光成像显示肿瘤接种部位有较强的荧光信号，荧光强度可以穿透裸小鼠的颅骨；而S D 大鼠活体不能观察到光学信号。处死动物进行脑组织体外成像时，见B A L B C 裸小鼠和S D大鼠脑组织肿瘤组织均有较强的近红外荧光。二、基于带氨
12、基介孔二氧化硅纳米颗粒磁共振和光学双模态探针的制备1 、介孔二氧化硅纳米颗粒的制备和表征根据参考文献的方法，O 4 9 十六烷基三甲基溴化铵溶于5 6 7 5 m l 去离子水中，加入3 5 2 m l 乙酸乙酯和1 2 1 2 m l 氨水，加入0 9m l 正硅酸四乙脂和1 1I I l l ( 3 氨丙基) 三乙氧基硅烷。将混合液在室温下以3 0 0 转分( r p m ) 充分搅拌反应2 4 小时( h ) 。去离子水清洗3 次，无水乙醇清洗1 次。在样品中加入1 2 0m l 无水乙醇和2 4 0 9 l 浓盐酸，在6 0 摄氏度水浴锅中搅拌反应3 h 。去离子水清洗3 次，定容至5
13、 m l 。I V博士学位论文场发射扫描电子显微镜的照片使用H i t a c h i $ 4 8 0 0 型扫描电子显微镜拍摄，加速电压为l k V 。透射电子显微镜( T E M ) 的照片使用日本J E O L 公司J E M 2 1 0 0 型透射电子显微镜拍摄，加速电压为2 0 0 k V 。通过测量约1 0 0 个纳米颗粒的直径，计算得到M S N s 小m 2 的平均粒径为1 2 0 h m ( 6 0 1 6 0r m a ) 。氮气吸附一脱附等温线使用北京金埃谱科技有限公司V - S o r b2 8 0 0 P 比表面积及孔径分析仪在1 9 6 0 C 测试，测试前将样品在
14、1 3 ，2 0 0 r p m 离心1 0 m i n 后，在7 0 0 C 烘箱内彻底干燥，研磨成均匀粉末状，并在1 8 0 0 C 条件下脱气6 小时。采用B r u n a u e r - E m m e t t - T e l l e r ( B E T ) 方法在吸附曲线p p D = 0 0 5 O 1 5 处计算样品的比表面积为4 7 3 m 2 g ；采用B a r r e R - J o y n e r - H f l e n d a ( B J H ) 分析法基于吸附数据计算M S N s - N H 2 的孔径为3 r i m 。介j ：L - - 氧化硅材料的傅立叶变
15、换红外光谱使用美国T h e r m oN i c o l e t 公司N E X U S 8 7 0 型傅立叶红外光谱仪测定。元素分析使用德国E l e m e n t a r 公司V a r i oM I C R O 型元素分析仪表明M S N s - N H 2 的质量百分含量为2 6 7 。使用英国M a l v e m 公司N a n o Z 型Z e t a 电位仪分析定容后M S N s - N H 2 的Z e t a 电位为+ 3 2 m V 。2 、M S N s 删N I R 双模态成像分子探针的构建和表征0 7 m g 近红外花菁类染料I R - 8 0 8 和4 m
16、l0 1 摩尔每升的G d D T P A 溶液加入2 0 m lM I S S 缓冲液( O 1 M ) 中；加入N 羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐0 4 m g ，室温下避光搅拌2 h ：然后加入1 乙基( 3 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐0 6 m g ，室温下避光搅拌活化反应3 - 一4h 。加入l m l 介- 孑L - - - 氧化硅溶液，避光反应过夜。使用美国T h e r m oN i c o l e t 公司N E X U S8 7 0 傅立叶红外光谱仪分析介孔二氧化硅修饰I R - 8 0 8 和G d D T P A 前后的近红外光谱。紫外可见吸收光谱检测表明I R - 8 0 8 与M S N s - N H 2 的连接系数为0 3 ；美国P E 公司O P T I M A5 3 0 0 D V型电感耦合等离子体发射光谱仪I C P 显示M S N s G d N I R 中钆的浓度为0 0 0 9M ：不同
