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1、山西医科大学博士学位论文肌动蛋白降解规律与死亡时间推断的相关性研究研究生：刘杨专业：法医学导师：王英元摘要研究背景：肌动蛋白是构成细胞骨架的主要蛋白质之一，几乎可表达于所有的真核细胞。现已证实心肌和肝脏内肌动蛋白的死后降解规律具有时间相关性，可用于死亡时间推断。但是机体死后各脏器之间肌动蛋白的降解规律是否具有差异性? 环境因素( 如温度、湿度) 、人为因素( 如致死方式) 是否会对肌动蛋白的死后降解造成的影响? 肌动蛋白的死后形态学改变是否也与死亡时间具有相关关系? 以及在人体组织内，肌动蛋白的死后降解规律是否也具有时间相关性? 目前有关这些问题还未见有研究报道。因此，本次实验将对上述这些问题
2、进行探讨。实验目的：( 1 ) 观察大鼠死后不同时间心、肝、脾、肺、肾、脑和骨髂肌等组织内肌动蛋白的含量变化，为晚期死亡时间推断寻找参考指标。( 2 ) 探讨大鼠骨骼肌肌动蛋白纤维的形态学变化与死亡时间的相关性。( 3 ) 研究不同温度条件下大鼠骨骼肌肌动蛋白死后降解规律的差异性。( 4 ) 探讨环境湿度对大鼠骨骼肌肌动蛋白死后降解规律的影响。( 5 ) 比较不同死亡原因对大鼠骨骼肌肌动蛋白死后降解规律的影响。( 6 ) 探讨大鼠骨骼肌肌动蛋白的降解规律与离体时间的关系。( 7 ) 探讨入体胸大肌肌动蛋白含量变化与离体时问的关系。实验方法：( 1 ) 大鼠经机械性窒息法致死后随机分为7 组，分
3、别于死后0 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0和1 6 8 h 剖取心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌等组织，采用免疫印迹及图像分析技术检测上述组织内肌动蛋白的含量，应用S P S S l l 5 软件对所得数据进行统计学分析。( 2 ) 分别采用光学显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和透射电镜对大鼠死后不同时间骨骼肌( 右后肢的内收大肌) 肌动蛋白纤维的形态学变化进行观察。( 3 ) 应用免疫印迹及计算机图像分析技术，测量并分析在不同温度条件下( 1 0 、2 0 和3 0 “ C ) 大鼠死后1 6 8 h 内骨骼肌肌动蛋白的含量变化差异。( 4 ) 对不同湿度条件下( 3 0 、
4、5 0 和7 0 ) 大鼠死后0 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0 和1 6 8h 骨骼肌肌动蛋白的含量进行检测。( 5 ) 将大鼠分别采用机械性窒息、失血性休克和电击法致死，采用免疫印迹及计算机图像分析技术检测并分析不同致死方式组大鼠死后1 6 8 h 内骨骼肌肌动蛋白的含量变化差异。( 6 ) 采用免疫印迹及计算机图像分析技术检测大鼠骨骼肌离体0 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、山西医科大学博士学位论文1 2 0 和1 6 8 h 时肌动蛋白的含量，观察其含量变化与离体时间的关系。( 7 ) 收集外科手术中切除的人体胸大肌组织，置于人工气候箱内保存( 恒温2
5、0 。C ，湿度恒定5 0 ) ，采用免疫印迹及计算机图像分析技术检测其离体0 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0 和1 6 8 h 后肌动蛋白的含量。实验结果：( 1 ) 大鼠死后，其心肌、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌等组织内肌动蛋白含量均随死亡时间的延长而逐渐下降，与死亡时间具有相关性。但肌动蛋白在上述各器官内的死后降解速度有差异( P 肺( 7 4 1 ) 脾( 1 0 9 3 ) 肝( 1 4 8 6 ) 肾( 1 9 9 2 ) 心( 2 7 8 3 ) 骨骼肌( 2 9 9 2 ) ( 括号内为死后1 6 8 h 时肌动蛋白的含量占死亡即刻时含量的百分数) 。其他时
6、间点肌动蛋白含量的相对变化以死后某一时间点肌动蛋白的含量占死亡即刻含量的百分数来反映，详见表3 、4 和图3 。各脏器肌动蛋白印相对含量的可信区间及其预测区间见图4 - 1 0 。 3 讨论3 1 肌动蛋白的生物学特性肌动蛋白是由高度保守的管家基因a c t i n 编码的、几乎存在于所有真核细胞内的一种高度保守蛋白家族，根据其亚单位构造的不同主要可以分为：a 、1 3 、Y 三种异构体，a a c t i n主要存在于肌肉细胞H 7 1 ，1 3 - a c t i n 和T - a c t i n 共同存在于大部分非肌肉细胞。但在每个细胞中都存在着编码这三种肌动蛋白的基因，在各类细胞中，这
7、些基因的表达则受到严格的调控。肌动蛋白在细胞中有两种功能状态：球形肌动蛋白( g l o b u l a ra c t i n ，G a c t i n ) 和纤维状肌动蛋白( f i b r o sa c t i n ，F a c t i n ) 呻3 。在A T P 的作用下G a c t i n 可以聚合成F a c f i n ，F a c t i n也可以解聚成G - a c t i n ，这是肌动蛋白最为重要的特性咖5 。在电子显微镜下观察，F a c t i n是种长的、具有弹性的纤维，直径平均在7 - 9 n m 之间，平行于质膜排列，形成纤维网络结构，可为细胞膜提供一定的强度
8、和韧性，以维持细胞形状。同时，细胞的多种运动，如胞质环流( c y c l o s i s ) 、阿米巴运动及吞噬( p h a g o c y t o s i s ) 都与肌动蛋白的多聚化密切相关。山西医科大学博士学位论文肌动蛋白在真核细胞内呈构成性表达，是真核细胞中含量最丰富的蛋白质( 肌细胞内占细胞内总蛋白的1 0 ，非肌细胞内为1 5 ) ，并且在肌细胞内肌动蛋白是稳定的结构，不发生组装和解聚的动态变化嵋2 咱引，因此肌动蛋白常常被用作内源性的参照物用于各种蛋白质表达的研究汹r 躺引。本次实验结果也证实正常对照组大鼠的各组织脏器内均有肌动蛋白的表达，且含量稳定。但在正常对照组不同脏器内
9、肌动蛋白的含量有差异，表明肌动蛋白的含量可能与细胞的功能有关。3 2 大鼠死后各脏器肌动蛋白的含量变化本次实验发现大鼠死后不同脏器内肌动蛋白含量随P M I 的延长均呈逐渐下降的趋势。各脏器组进行组内比较时，肌动蛋白的死后含量变化差异具有统计学意义( 尸 P M I 2 4 h ) 和死亡后期( P M I 7 2 h ) 三个阶段，以每个阶段内肌动蛋白含量变化曲线的斜率来表示该时间段的含量变化速度( 详见表8 ) ，可见在低温组和中温组，骨骼肌肌动蛋白的降解都经历了一个先低速后加速再减速的过程，而在高温组，则呈现先高速后持续减速的过程。在不同温度组的不同阶段，大鼠骨骼肌肌动蛋白的含量变化与P
10、 M I 的相关性也并不完全相同( 详见表9 ) 。3 湿度对大鼠骨骼肌肌动蛋白死后降解规律的影响3 1 实验分组健康成年S D 大鼠1 2 只，雌雄不拘，体重2 0 0 - a ：1 0 9 ，随机分为3 实验组( 高湿组、中湿组和低湿组) ，每组4 只。各实验组大鼠经机械性窒息法处死啪3 ，置于R X Z 智能型人工气候箱内保存。气候箱内湿度条件分别设定为：高湿组恒湿7 0 ；中湿组恒湿5 0 3 低湿组。恒湿3 0 ，温度均设定为2 0 。( 注：中湿组即上一部分的中温组)3 2 检材的提取及样品的处理和检测参见本章第2 2 2 3 部分。3 3 实验结果不同湿度组大鼠死后1 6 8 h
11、 内骨骼肌肌动蛋白免疫印记条带变化趋势见图2 9 。各湿度组分别进行组内比较时，不同取材时间骨骼肌肌动蛋白含量差异具有统计学意义( P 0 0 5 ) ，其余各组的含量差异具有统计学意义( 尸 O 0 5 =组间比较：& 与人体组比较p O 0 5 c o m p a r e dw i t ho t h e rg r o u p ：A sc o m p a r e dw i t ht h eh u m a ns p e c i m e n sg r o u p ：p 7 1 时，C o f i l i n 切割F 肌动蛋白并阻隔肌动蛋白单体嘞】。肌动蛋白相关蛋I 刍( a c t i n -
12、r e l a t e dp r o t e i n s ，A r p s ) 是近年在许多生物中发现的一类新的蛋自家族。根据最初鉴定的与传统的肌动蛋白同源性，共分l O 个家族，按照它们与肌动蛋白同源性递减的程度依次称为A r p l - - - l O 口们。A r p 具有肌动蛋白相似的折叠结构域，尤其是含有许多能与A T P 结合的氨基酸残基，推测a r p 可能具有A T P 依赖的调节蛋白质构象的能力口。a r p l - - 一3 分布于所有的真核细胞，它们的亚细胞定位与肌动蛋白相同，A W l 与肌动蛋白的同源性高达4 5 ，是A r p 家族中惟一能够聚合成短纤维的蛋白。目前
13、认为a r p 2 和a r p 3 复合物在真核生物中对控制肌动蛋白动态平衡起核心作用，具有使肌动蛋白聚合和使肌动蛋白纤维尖端加帽及交联肌动蛋白纤维成网状结构的能力 7 2 o A r p 4 1 0 分布在细胞核，它们与肌动蛋白的同源性介于1 7 3 0 之间，其中A r p 4 ，加p 5 ，A r p 7 ，A r p 8 和m p 9 是染色质改构复合物和组蛋白乙酰化去乙酰化复合物的成分。3 细胞核肌动蛋白的功能3 1 细胞核肌动蛋白与染色质结构调整哺乳动物细胞中h B R M 和B R G 的基因产物，具有染色质改构活性，与它们紧密结合的一组蛋白，被称为B A F s ( B R
14、Go rB r ma s s o c i a t e df a c t o r s ) ，3 - 肌动蛋白已被证明是B A F 复合物的成分，完整复合物的装配及复合物与核骨架的稳定结合需要B 肌动蛋白、B A F 5 3 及B R G I ( B A F 复合物的核心亚基) 的共同存在H 引。已有证据表明，染色质改构复合物中的肌动山西医科大学博士学位论文蛋白可以调节B R G I 的A T P a s e 活性，通过提供能量促进染色质改构和基因转录。所有A r p s都具有肌动蛋白折叠基序，提供一种柔性的、绞链样的结构域，这种结构域能够以A T P依赖的方式进行构型改变。因此，A r p s
15、可能是作为分子开关结合并水解A T P ，以此调节染色质改构复合物的活性。3 2 细胞核肌动蛋白参与基因转录活动有研究提示细胞核内G a c t i n 的水平可能调节和控制着基因的转录活动，可能参与了大多数R N A 聚合酶I I 介导的基因转录活动口5 ，删。新近的研究表明，细胞核肌球蛋白I 能够与R N A 聚合酶I I 共定位并相互作用，针对细胞核肌球蛋白I - N 端的1 6 个氨基酸的抗体可从细胞裂解物中免疫去除细胞核肌球蛋白I ，不仅阻断R N A 聚合酶I I 介导的体外基因转录口7 l ，还抑制时蛆聚合酶I 介导的基因转录。结合有关肌动蛋白的研究结果表明，以肌动蛋白为基础的肌
16、球蛋白分子马达参与了细胞核内基因转录活动肌球蛋白I 可以作为一个很好的核内肌动蛋白依赖的动力分子，肌动蛋白肌球蛋白分子马达推动编码核糖体和蛋白质转录相关复合物的延伸删。3 3细胞核肌动蛋白参与R N A 的加工与运输储存在细胞核中的遗传信息转录后形成R N A 前体，经剪切和加工成为成熟的m R N A ，然后运输到细胞质中表达。N a k a y a s u 和U e d a 发现牛淋巴细胞中的s n R N A 锚定在核骨架的肌动蛋白纤维上，既使经过胰蛋白酶消化，s n R N A 仍与肌动蛋白纤维结合，推测肌动蛋白可能通过与s n R N A 相互作用间接地参与m R N A 的剪切过程。在大鼠肝细胞中，肌动蛋白和D B P 4 0 是4 0 s 的h n R N P 颗粒成分，在该复合物中肌动蛋白与D B P 4 0 和p o l y ( A ) R N A 相互作用吲。对双翅目摇蚊多线染色体的
