分析生物学讲义-7。基因克隆技术

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1、基因克隆技术克隆(clone)无性繁殖基因克隆DNA的无性繁殖，永远保存和复制u基因克隆（分子克隆molecular cloning）通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。u基因克隆的核心-体外重组(Recombination)人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。一、 DNA重组技术美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。 1973年，科恩（S.Co

2、hen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。DNA重组技术 获得目的基因 构建重组 DNA 导入受体细胞 rDNA筛选鉴定载体DNA（vector ）目的DNA（target fragment ）重组DNA（recombinant DNA ）宿主（host ）筛选、扩增克隆（clone）DNA 重组转化（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；（3）利用聚合酶链

3、式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段。（4）化学合成1.获得目的基因（1）基因组文库的构建总DNA经过酶解 琼脂糖凝胶电泳分离 不 同长短的DNA片段分别克隆在载体上 转染细 菌等受体便构成了该生物的基因组文库。（2） 反转录人工合成互补DNA, cDNA文库构建基因组文库获取目的 基因存在的问题费时费事内含子序列反转录人工合成互补DNA 方法的优势获取的DNA片段往往是具 有特定功能的目的基因2. 构建重组DNA（1）“基因剪刀” 限制性内切酶（2）“缝纫针” DNA连接酶（3）“交通工具” 载体（1）限制性内切酶分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性

4、内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点。根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母罗马字母、 从一种微生物中发现了几种限 制酶，按发现顺序排列如EcoR是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。分子刀-DNA限制性内切酶识别特定的核苷酸序列46个碱基对形成粘性末端或平端（2）DNA连接酶常用T4DNA ligase：来源：噬菌体T4感染Ecol

5、i分离的一种单链多肽酶功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用。对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）（3）载体（vector）载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小（6）细胞内稳定性高目前最常用的载体包括细菌质粒、噬菌体、柯斯质粒等。克隆片段的大小（克隆能力）(1)1kb M13(2)10kb plasmid(3)22kb phage(4)50kb casmid由噬菌体DNA和质粒DNA的某些功

6、能片段拼接而成 (5)0.1-0.4Mb BAC细菌人工染色体(6)0.5-2Mb YAC 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个 质粒可以大量增加其拷贝数。质粒重组DNA的操作3.导入受体细胞a. 导入目的: 扩增表达b.受体细胞: 原核细胞 既可以复制扩增，也可以基因表达。真核细胞 一般只用作基因表达系统。c. 转化和转染（transformation/transfection）rDNA导入原核细胞的过程称转化，导入真核称转染。注：transformation 质粒导入细菌的过程；transfec

7、tion 噬菌体，病毒或以它作为载体构建的重组子导入；transduction 以噬菌体为媒介导入外源DNA分子。a.低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态;b.转化混合物中的DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面;C.重组DNA在42短时间热激后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。CaCl2法制备感受态细胞感受态细胞连接的DNA4 30mim42 90sec热激 （heat-shock）复苏（ 37 培养）涂平板4.rDNA的筛选鉴定筛选： 抗性筛选 蓝白斑筛选 鉴定： 酶切电泳 Sou

8、thern 杂交蓝白斑筛选 -互补（-complementation）： 在T-vector或 PUC质粒序列中，插入了lac启 动子-操纵子基因序列以及编码-半乳糖苷酶N- 端145个氨基酸的核苷酸序列（又称-肽）； 这类载体对应的宿主菌（如JM、DH5系列） -半乳糖苷酶基因失去了编码-肽碱基序列 只有当这类载体引入到宿主菌后，互补产生有 活性的-半乳糖苷酶。若在多克隆位点插入外源基因，将使lac Z基因片段灭活，不能产生-互补现象，不能生成蓝色菌落，而保持白色 。X-galX-galLacZ在外源诱导物IPTG和人工底物X-gal加入蓝色化合物重组子重组子 (5-溴-4氯-3-吲哚-D-

9、 半乳糖苷) 一是从基因产物追溯到基因，二是分离突变体，把正常的和突变的进行比较，找出有差异的DNA或RNA。然后，分别以正常DNA和变异的DNA（也可能是有无）进行功能验证，证明这段DNA确实控制这个性状，那么这个基因的分离就完成了。二、 基因克隆策略过去分离基因主要是根据基因的产物，蛋白 质和mRNA，追溯、返推到基因，但是编码产物清楚又有足够表达量的基因人们知道的还很少， 因此基本上都已克隆过了。而需要去克隆的重要 基因几乎都不知道其编码产物。因此，分离目标 性状的特异的突变体，通过对突变基因进行精细 定位，进而对该基因进行图位克隆，或根据突变 体的差异表达，利用DDRT-PCR、SSH

10、、mRNA -AFLP等技术把特异性表达产物扩增、放大，达到可以检测的水平，直接把目标基因克隆，已成 为近代基因克隆的两条主要途径。基因克隆方法的选择 类型I已知基因的序列已知目的基因的DNA/cDNA全部或部分DNA/cDNA序列或已知其它物种的同类基因的序列。 在这两种情况下一般采用PCR技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。 类型II未知目的基因序列（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术，mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）和差示分析法（RAD）等进行克隆。（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测序法

11、等进行，是难度较大较繁琐的策略。 类型III无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆。 1.RACE技术 （rapid amplification of cDNA ends） 在已知cDNA 序列的基础上克隆5端或3 端缺失序列的技术。 应用：获得全长cDNA，还用于识别5和3端非 转 录序列，研究转录起始位点的不均一性和启动 子区的保守性。 分为5-和3-RACE两种。 3-RACE根据一般基因具有polyA尾巴的特点，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，再用特异引物（GSPs）和PolyT引物PCR即可。 5-RACE相对较难

12、，先用特异引物（GSPs）起始cDNA第一条链的合成，再根据反转录酶末端加C特点,利用dC引物和GSPs PCR 。 2.cDNA差示分析法（Representational Difference Analysis，RDA） 原理： 利用PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。3.图位克隆法Map-based cloning 首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到 某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁 的RFLP或RAPD分子标记。 其次，通过对许多不同的生态型及大量限制性

13、内 切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近 的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标 记之间的基因片段克隆并分离出来。 然后，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。基因敲除技术 研究基因功能的方法主要有两种思路，一 是通过增强其表达，取得表达产物进行研究 ，二是减弱或者终止其表达，观察整体功能 的变化，进而推测相应的基因功能。 定义：将细胞基因组中某基因去除或使基 因失去活性的方法。常用同源重组的方法敲 除目的基因，观察生物或细胞的表型变化 。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。 完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除; 条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段，即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除。 利用同源重组进行基因敲除 利用随机插入突变进行基因敲除 RNA干扰引起的基因敲除 RNA干扰(RNAi nterference,RNAi)是一种 普遍的转录后基因沉默的机制，siRNA( sm all intereferenceRNA)引起，能够介导RNA干 涉现象，诱导出一种由siRNA分子、核酸酶 以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复 合物。