《冷应激冷适应游泳对大鼠血液流变性及主动脉NO,NOS影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《冷应激冷适应游泳对大鼠血液流变性及主动脉NO,NOS影响（29页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、冷应激和冷适应游泳对大鼠血液流变性 及主动脉N O ，N O S 的影响硕士生姓名：金平平 指导教师：吕国枫教授专业名称：运动医学摘要目的：本实验结合冬泳的两个要素规律游泳运动和冷适应，以S D 大鼠为实验对象，模拟冬泳运动。研究冬泳运动对于血液流变性和主动脉N O 、N O S的影响，并讨论其影响机制。材料及方法：用纯系普通雄性S D 大鼠3 0 只，l O 月龄左右，体重1 8 5 + 1 5 9 。温度2 0 - a ：3 “ C ，相对湿度5 0 - a ：5 。大鼠分笼饲养，每笼3 “ - 4 只。自然光照，自由进食饮水。大鼠适应性饲养3 天后，随机分成三组，对照组1 0 只，冷应激
2、组l O 只，冷适应组1 0 只。对照组：不运动，实验第7 周处死。冷应激组：不运动，第6 周末进行适应性游泳训练3 天，第7 周在8 “ C 水温中运动一次，时间8 m i n ，运动后即刻处死。冷适应组：适应性游泳训练3 天，之后进入正式训练，训练6 周。第7周在8 “ C 水温中运动一次，时间8 m i n ，运动后即刻处死。每周定期称量大鼠体重。处死大鼠时，以断头取血方式，取血注入E D T A 抗凝管。取血后立即送检大连医科大学附属第二医院检验科，做临床血液流变学指标测试。开腹腔后，迅速完全分离出主动脉。取材用N O S 试剂盒、N O 试剂盒等做生化检测。结果：冷适应游泳组一般情况
3、良好，在训练至第三周时，体重增加明显低于冷应激组和安静对照组( P O 0 5 ) 。冷应激组的屈服应力、卡松粘度和红细胞电泳时间均呈上升趋势，而冷适应游泳组呈缓解的趋势。但是均不显著( P O 0 5 ) 。冷应激组主动脉N O 含量呈减少趋势，但是并不显著( P O 0 5 ) 。而冷适应游泳组N O 含量反而呈显著上升( P 0 0 5 ) I nt h ec o l ds t i m u l a t i o ng r o u p ，t h es t r e s sy i e l d ，t h eC a s s o nv i s c o s i t ya n dt h ee r y t
4、h r o c y t ee l e c t r o p h o r e t i ct i m ea l lr a i s e d ；i nt h ec o l d a d a p t a t i o ng r o u p ，t h e s ef i g u r e sa l lh a dac a t a b a t i ct r e n d B u tt h e yw e r eb o t hn o ts i g n i f i c a n t ( P O 0 5 ) I nt h ec o l ds t i m u l a t i o ng r o u p ，t h eN Oc o n t
5、 e n tr e d u c e d ，b u tW a sn o ts i g n i f i c a n t( P O 0 5 ) ；i n s t e a di nt h ec o l d - a d a p t a t i o ng r o u p ，t h eN Oc o n t e n ti n c r e a s e d ( P 9 9 5 ) ：天津市北方天医化学试剂厂2 蔗糖：沈阳新兴试剂厂3 氯化钠：沈阳新兴试剂厂4 三羟甲基氨基甲烷“ I r i s ：沈阳新兴试剂厂5乙二胺四乙酸二钠E D T A ：沈阳新兴试剂厂6 一氧化氮合酶( N O S ) 测定试剂盒：南京建
6、成生物工程研究所7 一氧化氮( N O ) 测定试剂盒：南京建成生物工程研究所8 总蛋白定量测定试剂盒：南京建成生物工程研究所( 三) 主要仪器：1 手动玻璃匀浆器：中国2F A 2 0 0 4 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司32 P - 2 0 0 振荡器：江苏太仓科教器械厂4D R A O N 移液枪：芬兰51 0 0 恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂6 可见光分光光度计：G B C 科技仪器公司7 台式离心机：上海精密科学仪器有限公司8E D T A 抗凝管：大连医科大学附属第二医院提供( 四) 应用软件1W O R D 2 0 0 32E X C E L 2 0 0 3
7、3S P S S1 1 5二实验方法( 一) 实验动物饲养，分组及运动训练方案l 饲养及分组选用纯系普通雄性S D 大鼠3 0 只，1 0 月龄左右，体重1 8 5 - a ：1 5 9 。温度2 0 d ：3 * ( 2 ，相对湿度5 0 - a ：5 。大鼠分笼饲养，每笼3 “ - 4 只。自然光照，自由进食饮水。大鼠适应性饲养3 天后，随机分成三组，对照组1 0 只，冷应激组1 0 只，冷适应组1 0 只。62 运动训练方案2 1 游泳条件：塑料圆筒，直径8 0 厘米，桶壁光滑，水深6 0 厘米，为大鼠身长的2 倍以上。为避免动物间的干扰，每桶3 “ - - 4 只大鼠。游泳过程中用玻璃
8、棒驱赶大鼠以防其漂浮水面。游泳结束后用干燥毛巾擦干大鼠。2 2 各组运动训练方案对照组：不运动，实验第7 周处死。冷应激组：不运动，第6 周末进行适应性游泳训练3 天，每天一次，水温3 0 。C ，时间1 5 m i n 。第7 周在8 水温中运动一次，时间8 m i n ，运动后a P N 处死。冷适应组：适应性游泳训练3 天，每天一次，水温3 0 。C ，时间1 5 r n i n 。之后进入正式训练：每天一次，起始水温3 0 。C ，时间4 0 m i n ，从第二天起水温每天下降2 “ C ，运动时间每天缩短3 m i n ，每周训练6 天，持续2 周i 6 7 1 。从第3 周起保持
9、在水温为1 0 ，训练时间为5 m i n 水平，训练6 周。第7 周在8 水温中运动一次，时间8 m i n ,运动后即刻处死。( - - ) 取材与具体操作1 体重数据记录每周定期称量每只大鼠体重，并记录在案。最后一次称重于开始运动前。2 取材处死大鼠时，以断头取血方式，取4 m l 血液直接注入E D T A 抗凝管，随即轻颠倒3 - 4 次。取血后立即送检大连医科大学附属第二医院检验科，做临床血液流变学指标测试。开腹腔后，迅速完全分离出主动脉，放入4 “ C 生理盐水中，清除表面脂肪组织及红细胞等。放在滤纸上吸干水分，分组对号保存与8 0 。C 冰箱备用。3 匀浆介质制备1 0 0 0
10、 m lP H 7 4 ，0 0 1 m o l LT r i s - H C L ，0 ，0 0 0 1 m o F LE D T A - 2 N a ,0 0 1 m o l L 蔗糖，O 8 氯化钠溶液。称取：T r i s1 2 1 9E D T A - 2 N a3 7 2 3 9蔗糖3 4 2 9氯化钠8 9将T r i s1 21g 及E D T A 2 N a3 7 2 3 9 加水5 0 0 m l ，再用2 0 0 m m o l LH C L 进行滴定至P H 7 4 ，然后加入3 4 2 9 蔗糖，8 9 氯化钠，再用蒸馏水补充至1 0 0 0 m l ，用微波炉消毒3
11、 “ - - 5 分钟后放4 冰箱备用。4 组织样本制备将已保存在8 0 “ C 冰箱的主动脉标本移出，室温下复温。准确称取组织重量，7与匀浆介质按重量体积比1 ：1 9 ，制成5 的组织匀浆，以2 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n 。取上清注入E P 管中，置于4 。C 冰箱中待测。5 主动脉N O S 、i N O S 活力测定5 1 原理N O S 催化L - A r g 和分子氧反应生成N O ，N O 于亲核性物质生成有色化合物，在5 3 0 r i m 波长下测定吸光度，根据吸光度大小可计算出N O S 的活力。5 2 试剂组成于配制试剂一：底物缓冲液6 m i
12、x 4 瓶，- 2 0 以下避光冷冻保存。临用前化冻摇匀。试剂- - ：促进剂粉剂x 6 支，稀释液0 6 m l x 6 支。- 2 0 以下冷冻保存。测试前取稀释液一支0 6 m l 加入一支粉剂中充分混匀。试剂三：黄色显色剂6 m l x 2 瓶，4 避光冷藏保存。试剂四：透明剂6 m l x 2 瓶，室温保存。使用前3 7 “ ( 2 水浴使其澄清。试剂五：终止剂6 0 m i x 4 瓶，4 保存。使用前3 7 水浴使其澄清。试剂六：液体1 0 m l x l 瓶，4 保存。用前仔细观察，有捷径附着于瓶壁，将试剂连同瓶子一起在1 0 0 “ C 热水中摇晃至其完全溶解后，即可使用。5
13、 3 操作步骤：组织样本及试剂从冰箱中取出，室温放置数分钟。所加样本量由预实验确定。T O N S 空白管T O N S 测定管i N O S 空白管 l N O S 测定管双蒸水( 山)1 8 01 0 08 0样本( 山)8 08 0试剂六抑制剂( 山)1 0 01 0 0摇晃一下试管架试剂一底物缓冲液( 山)2 0 02 0 02 0 02 0 0试剂二促进剂( “1 )1 01 01 01 0试剂三显色剂( 山)1 0 01 0 01 0 01 0 0混匀，3 7 水浴准确反应1 5 分钟试剂四透明剂( 山)1 0 01 0 01 0 01 0 0试剂五终止剂( 山)2 0 0 02
14、0 0 02 0 0 02 0 0 0混匀，5 3 0 n m 处，l e n a 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。85 4 计算公式T N O S 活力T N O S N 定管O D 值一T N O S 空白管0 D 笸反应液总体积 ( u 唧加f ) 2 1 酒孺丽啄沥砑甄一丽矿T N O S N 定管O D 值一T N O S 空白管O D 值2 5 1 + 0 0 8 1蛋白含量 = = 一 一 一卞3 8 3 1 0 0 0 81 1 5 ( m g p r o t L )i N O S 活力i N O s i 贝0 定管o D 值一i N O S 空白管O D 值反应液总体积(
15、U m g p r o t )成色物纳摩尔消光系数取样量蛋白含量( m g p r o t L )1蛋白含量 研甄孺而丽( 唧加t L )i N O S 测定管O D 值一i N O S 空白管O D 值2 5 1 + 0 0 8 1蛋白含量-=-_-_-_-_-_。一一一下3 8 3 1 0 0 0 81 1 5 ( m g p r o t 三)96 主动脉N O 测定6 1 原理N O 化学性质活泼，在体内代谢很快转为N O ；和N O ；，而N O ；又进一步转化为N O ；，本法利用硝酸还原酶特异性将N O ；还原为N O i ，通过显色深浅测定其浓度的高低。6 2 试剂组成与配制试剂
16、一：液体，6 m l x 2 瓶，- 2 0 保存。使用前3 7 水浴溶解。试剂二：液体，6 m l x 2 瓶，- 2 0 以下保存。使用前3 7 水浴溶解。混合试剂的配制：按试剂一：试剂- - - 1 ：1 配制，配好后充分混匀后待用。试剂三：液体，1 2 m l x l 瓶，室温保存。试剂四：液体，6 m l x l 瓶，室温保存。试剂五：粉剂x 1 支，加1 0 0 热双蒸水至2 0 m l ，充分溶解，避光保存。试剂六：粉剂x 1 支，加双蒸水至8 m l ，避光冷藏保存。试剂七：液体，8 m l x l 瓶。室温保存。显色剂的配制：试剂五：试剂六：试剂七= 2 5 ：1 ：1 ，避光保存。1 0 m m o l L 标准品0 5 m l x
