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1、1注射用重组双功能水蛭素产品质量研究张艳玲，莫 炜 ，王龙生，杨新英，宋后燕 【摘要】 本实验室构建了分泌型高效表达重组双功能水蛭素 (RGD-Hirudin) 的工程酵母，经发酵、纯化，获得重组双功能水蛭素纯品，其原液经质量分析，符合国家静脉注射用药的标准，可以用于制备静脉注射用粉针剂。【关键词】 注射用重组双功能水蛭素；质量研究【Abstract】 The expression plasmid，HD-pPIC9K，was contructed by inserting cDNA of RGD-hirudfin (RGD-Hirudin) in yeast expression vector
2、 pPIC9K. This clone was fermented for 3 days，and the purified RGD-Hirudin was gained after purification. Quality analyses were tested. The RGD-Hirudin was measured up to standard of injection.天然水蛭素是凝血酶的特异抑制剂，从医用水蛭的唾液腺中提取而得，可与凝血酶形成摩尔比为 1:1 的非共价相结合的可逆复合物，对凝血酶有很高的亲和力，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，2抑制纤维蛋白的形成，因此，低浓度的
3、水蛭素可有效地抑制血液凝固1 。我们在保留天然水蛭素原有的生物学作用的基础上，将 RGD 编码顺序融合在天然水蛭素 cDNA 基因中25 。构建了含RGD 编码顺序的水蛭素 cDNA 克隆 HD-pPIC9K，表达质粒转化毕赤酵母后，经筛选获得高表达菌株，并建立工程菌株，实现了高效、分泌型表达 (另文发表) 。本文重点报道重组双功能水蛭素原液的质量研究。1 材料与方法1.1 抗凝比活性测定1.1.1 试剂的配制 0.5%纤维蛋白原：纤维蛋白原( 上海莱士血制品有限公司)0.5g ，以 100ml 生理盐水溶解。凝血酶：中国生物制品检定所制备的凝血酶，依照标示量，用生理盐水复溶后成100NIU/
4、ml。阴性对照：以生理盐水为样品，凝血酶加入后立即凝固。标准对照：德国 Hochest 公司生产的 Refludan，按照其标示活性溶解分装成 1600ATU/支 (即 0.1mg/支)，冻干，具体操作步骤按说明书进行。31.1.2 方法 凝血酶滴定法1 ( 所有过程在 37水浴中操作)。1.1.3 抗凝活性计算 抗凝活性 (ATU/ml)=(n-1)100稀释倍数，n 为添加凝血酶的次数，1 为扣除本底 1 次(即最后一次加入凝血酶，纤维蛋白原凝固)，100 为凝血酶活性单位 100 NIU/ml，稀释倍数为所测定样品的稀释倍数。1.1.4 蛋白含量测定 按改良 Lowry 法进行6 。1.
5、1.5 抗凝比活性 抗凝比活性 (ATU/mg)单位抗凝活性 (ATU/ml) / 单位蛋白含量 (mg/ml)。1.2 抗血小板聚集比活性测定71.2.1 试剂的配制 ADP：Sigma 公司，用生理盐水溶解并稀释，配成 400mol/L 贮存液，-20保存。1.2.2 血小板来源 正常志愿者。1.2.3 仪器 血小板聚集仪(上海斯隆医电设备有限公司)。41.2.4 方法 按说明书操作。1.2.5 结果判定 血小板聚集抑制率：以未用药测得的血小板聚集率作为空白对照，体外给药后，测得的血小板聚集率除以空白对照所得的比值为相对聚集率，此相对聚集率与 1 的差值即血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率
6、1 ( 用药后测得的血小板聚集率 /空白对照)1.3 纯度测定 高效液相色谱法(HPLC)6 。色谱主机：SHIMAZU， LC-10AD；色谱柱：DELTA PAK C18-300A，3.9mm15cm；流动相：A：水+0.1%TFA；流动相：B：90%乙腈+0.1%TFA；梯度：100min 内，流动相 B 从 0%到100%；流速：0.2ml/min ；样品浓度：1mg/ml；上样量：20l；检测波长：280nm。1.4 肽图分析 TPCK 处理的胰蛋白酶酶解 RGD-Hirudin 样品和理化对照品，分别以 C8 柱反相层析柱，0.1% TFA-H2O/0.1% TFA-乙腈为流动相，
7、214nm 波长检测，并用质谱测定各肽段分子量，计算总分子量6 。1.5 紫外光谱扫描 在 200400nm 波长范围内扫描 RGD-5Hirudin 样品和理化对照品6 。1.6 残留工程菌蛋白含量测定1.6.1 Pichia 酵母全菌蛋白制备 Pichia 酵母在 YPD 培养基中30培养，菌体超声波/机械破碎，得蛋白初提物水溶液，Lowry法定量。1.6.2 抗 Pichia 酵母全菌蛋白多克隆抗体制备 免疫动物：新西兰大白兔 (2.5kg，雄性 )；免疫蛋白：上述 Pichia 酵母全菌蛋白(20mg/只) ，体积比 1:1 与完全福氏佐剂混合。免疫方法：背部皮下多点注射(1ml/点)
8、，每周 1 次。多抗滴度：免疫 4 周后，取血，分离血清，双扩散法测定其效价，若高于 1:16，即颈动脉放血，分离血清(抗酵母全菌蛋白多抗) ；若低于 1:16，则继续按上述方法免疫动物，直至效价高于 1:16 为止。1.6.3 残留工程菌蛋白含量测定(ELISA) Pichia 酵母全菌蛋白系列浓度：100ng/ml、80ng/ml、60ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、0ng/ml。样品：1mg/ml。一抗：即自制抗 Pichia 酵母全菌蛋白多克隆抗体，稀释度为 1:100。二抗：华美试剂公司，羊抗兔 IgG-HRP，稀释度为 1:1000。显色方
9、法：邻苯二胺6/H2O2/pH5 柠檬酸缓冲液。比色方法：测定波长：492nm，参比波长：655nm。2 结果2.1 抗凝比活性 见表 1。 表 1 原液抗凝血酶活性测定 (ATU/ml)样品蛋白含量经改良 Lowry 法测定，为 24.40mg/ml；样品抗凝比活性 10，300ATU/mg，10，000ATU/mg。2.2 抗血小板聚集比活性 蛋白含量测定结果见表 2，图 1。表 2 原液抗血小板聚集活性测定结果图 1 血小板聚集抑制率曲线70.1mg/ml 原液 (体外给药) 对血小板聚集抑制率 10%，随着剂量的加大，可以看到显著的量效关系。2.3 纯度测定结果(HPLC) 见图 2。
10、样品的 HPLC 纯度为96.64%，95%，符合静脉注射的国家标准。图 2 高效液相色谱图2.4 肽图分析结果 见图 3。图 3 中显示：四个峰，即组分842.5100、1119.5825、2187.8209、2818.0970 为 RGD-Hirudin 经 TPCK 处理的胰蛋白酶消化后，所得的 4 个片段，与理论计算一致。它们的分子量总和与 RGD-Hirudin 的分子量一致。8图 3 质量肽图图谱2.5 紫外光谱扫描 见图 4。样品的特征吸收波长在 271.2nm。图 4 紫外吸收光谱图2.6 宿主菌蛋白残留量测定结果(ELISA) 宿主菌蛋白残留量为0.0022%。3 讨论药品的
11、质量控制是一项非常重要的工作，特别对于新药，质量控制尤为重要。对于不同用药途径的药品，质量要求也不一样，静脉注射用药的质量要求最高。检定的项目有纯度分析，比活性分析等12 项原液质量检定，本文总结了涉及静脉注射用药最为关键的质量指标的研究。我们教研室已经完成了重组双功能水蛭素的中试研究和临床前研究，产品的质量控制是其中最重要的研究内容，经过以上所有项目9测定，重组双功能水蛭素符合国家静脉注射用药的质量标准，获得了国家一类生物技术新药临床试用批件。 测定 Hirudin 抑制凝血酶活性的方法主要是凝血酶滴定法，其精密度为 100ATU。RGD-Hirudin 的抗凝比活性10000 ATU/mg
12、。我们研制的 RGD-Hirudin 是一种双功能的水蛭素，具有抗凝和抗血小板聚集双重功能，因此，我们建立了测定双重活性的规程，我们采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性。根据文献报道，阻断血小板膜糖蛋白 GPb/a 复合物的抗血小板药的最简便的测定其抗血小板聚集的方法为比浊法。由于这类药对于抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集效果最好，因此，本法采用比浊法测定 ADP 诱导的血小板聚集，观察不同给药剂量下的血小板聚集率的变化，以反应 RGD-Hirudin 的抗血小板聚集比活性。由于血小板聚集试验受外界各种因素的影响，变异较大，本法采用半定量的方法测定其抗血小板活性7 。注射用重组双功能水蛭素的
13、最终成品是一个混合物，组分中含分子量为 7030Da 的 RGD-Hirudin(3010)%和分子量为 7180Da的 RGD-Hirudin (7010)%，两者总和95%2 。质量肽图和紫外吸收光谱的测定是进一步对注射用重组双功能水10蛭素结构的确证，证明 RGD-Hirudin 是蛋白质 /多肽类药物。外源性残留物含量的测定包括工程菌菌体残留蛋白和残留 DNA 的测定，其中残留蛋白含量采用 ELISA 定量；残留 DNA 含量采用 Southern Blotting 斑点杂交的方法定量 (另文发表) 8 。【参考文献】1 Markwardt F， Sturzebecker J，Grie
14、ssbach U.Hirudin as an inhibitor of thrombin.Method in Enzymology，1970，19:924-932.2 张艳玲.毕赤酵母羧肽酶对重组双功能水蛭素 C 端的降解作用.中华中西医杂志，2005， 6(18):2441-2443.3 Modi NB， Baughman SA， Paasch BD， et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of TP-9201， a GP ba antagonist， in rats and dogs.J Cardiovasc Pharmacol，1995，
15、25:888-897. 4 Chang JY.The functional domain of hirudin， a thrombin-specific inhibitor. FEBS Lett， 1983，164:307-313.5 Smith JW，Tachias K， Madison EL.Protein loop grafting to construct a variant of tissue-type plasminogen activator that binds platelet integrin abB3. J Bio Chem， 1995，270:30486-30490.116 药典委员会.中华人民共和国药典( 三部 ).北京：化学工业出版社，2005，附录 16-17.7 Modi NB， Baughman SA， PaaschBD，et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of TP-9201， a GPba antagonist， in rats and dogs. J Cardiovasc Pharmacol，1995， 25:888-897.8 蔡旭.地高辛标记探针检测重组双功能水蛭素中残留 DNA 的含量. 药物生物技术，2004，11(6): 392-394.
