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1、葛根总黄酮对糖尿病大鼠神经结构和功能的影响 赵倩1,2 徐峰2 1. 山东理工大学生命科学学院山东 淄博 255049 2. 沈阳药科大学生理教研室辽宁 沈阳 110016 Effect of total flavone of pueraria labataon on nerve stucture and nerve function in diabetic rats ZHAO Qian1,2, XU Feng2 (1. Life Science School, Shan Dong University of Technology, Zibo, Shandong, 255049; 2. Dep
2、artment of Physiology, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning, 110016) 糖尿病周围神经病变是糖尿病常见的慢性并发症之一 随着病程的延长 发病率可高达 90%以上病变可累及运动神经感觉神经及植物神经近年来研究表明高血糖引起的醛糖还原酶活性升高多元醇通路异常活化是导致糖尿病神经病变的重要机制另外糖基化终产物在神经组织中的积聚以及自由基损伤也是引起神经结构和功能紊乱的重要原因本实验采用中药葛根的提取物葛根总黄酮total flavone of pueraria labataTFP治疗糖尿病大鼠观察了
3、葛根总黄酮对胰岛 B 细胞损毁大鼠的神经结构和功能的影响 1 实验材料 1.1 动物模型 选用成年 Wister 大鼠沈阳药科大学动物室提供雌雄各半体重 200250g实验过程中自由饮水 每 5 只大鼠一笼群养 大鼠禁食 12 小时后 给予链脲佐菌素 Streptozotocin STZ 溶液 60 mg/kg一次性腹腔注射72 小时后眶静脉取血测血糖将空腹血糖16mmol/L者选为糖尿病鼠三个月后经神经功能测试具有神经并发症表现的大鼠作为糖尿病神经并发症模型鼠 将入选的糖尿病大鼠随机分为 5 组每组 15 只第一组为糖尿病模型组按 10 ml/kg灌胃给予常水第二组为葛根总黄酮低剂量组按 6
4、30mg/kg 灌胃给予葛根总黄酮溶液第三组为葛根总黄酮中剂量组按 1260mg/kg 灌胃给予葛根总黄酮溶液第四组为葛根总黄酮高剂量组按 2520mg/kg灌胃给予葛根总黄酮溶液第五组为弥可保组按 270 g/kg灌胃给予弥可保溶液并以体重鼠龄相匹配的正常大鼠 15 只作为对照组按 10ml/kg灌胃给予常水每 2 周测定一次血糖痛觉及大鼠尾神经传导速度等连续给药三个月后取大鼠坐骨神经进行病理检查及测定坐骨神经山梨醇含量取大鼠脑测定脑中 MDAGSH含量及 Na+-K+-ATP 酶活性 1.2 试药 葛根总黄酮由鞍山第一制药厂提供批号020701链脲佐菌素StreptozotocinSIGM
5、A 公司产品 批号100K1677弥可保Methycobal日本卫材株式会社制造卫材苏州制药有限公司分装批号990870C戊巴比妥钠 上海行知化工厂 批号921019腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐ATPNa2 中国科学院上海神经化学研究所批号8903067哇巴因 OuabainSIGMA 公司产品 批号30K12075,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) DTNB Fluka 化学试剂公司提供 批号238511/1硫代巴比妥酸(TBA) 上海试剂二厂批号920620十二烷基硫酸钠SDS沈阳市新化试剂厂产品批号20000707四水合钼酸铵合肥工业大学化学试剂厂产品批号990906孔雀绿Fast Green德
6、国制衣产品批号32745 吐温-20ICI 英国进口分装中国医药公司北京采购供应站经销批号920920三羟基甲基氨基甲烷TrisE.M.K 进口分装对硝基苯甲酰氯P-Nitrobenzoyl chloride北京市兴津化工厂批号20011128血糖测定试剂盒保定长城临床试剂公司批号20010428糖化血红蛋白测定试剂盒由美国雅培公司提供批号20010508 1.3 仪器 PcLab 生物信号采集处理系统北京微信斯达有限公司提供721 分光光度计山东高密分析仪器厂 JEM- 1200 EX 透射电子显微镜日本生产高效液相色谱仪大连江申分离科学技术公司LC-10UV 检测器 大连江申分离科学技术公
7、司 PF3 多普勒血流仪 瑞典 Perimed Periflux Co. IMX 自动免疫分析仪 美国雅培公司热痛测试装置自制 2 实验方法与结果 2.1 每天观察大鼠体重动物的状态活动情况摄食饮水情况用葡萄糖氧化酶法测定血糖含量用离子捕获法测定糖化血红蛋白HbA1c 1 Tab1 Effect of TFP on body weight , blood glucose and HbA1c in experimental ratss Group Dose (g/kg) n Weight g Blood glucosemmol/L HbA1c (%) control 10 457.991.2 6
8、.192.91 7.550.89 DM 11 323.171.7# 28.229.91# 14.962.81# TFP (low) 0.63 11 366.636.2# 17.576.11#* 11.024.65 TFP (middle) 1.26 12 371.162.2# 18.895.92#* 11.922.54#* TFP (high) 2.52 11 378.954.6#* 17.989.43#* 11.152.65#* Methycobal 0.27mg/kg 10 365.046.4# 14.912.14#* 12.613.81# Compared with control gr
9、oup #P0.05#P0.01compared with DM group *P0.05 2.2 热辐射法测定痛觉潜伏期 将大鼠置于大鼠固定器内使大鼠的前半身可以自由活动尾由固定器后盖的圆孔处穿出任其自然下垂待大鼠安静后即可实验取 22v250w16mm小型聚光灯经透镜聚焦照射于大鼠尾部的下 1/3 处记录从照射开始到甩尾的时间作为痛阈指标2调节负载电压使正常大鼠在 6 秒左右出现甩尾每只动物测定两次取平均值 Tab 2 Effect of TFP on tail withdrawal reflex latency caused by thermal stimulation of exper
10、imental rats (s) Group Dose (g/kg) N Tail withdrawal reflex latency caused by thermal stimulation (second) Control 10 6.102.36 DM 11 9.642.86# TFP (low) 0.63 11 7.431.93* TFP (middle) 1.26 12 7.261.21* TFP (high) 2.52 11 7.522.84* Methycobal 0.27mg/kg 10 7.682.62 Compared with control group #P0.05#P
11、0.01compared with DM group *P0.05 * *P0.05 2.3 大鼠神经传导速度测定 将大鼠用 0.35%戊巴比妥钠麻醉后固定在接近尾根部处安置一对刺激电极并在尾部远心端和近心端各安置一对输入电极测量两对输入电极之间的距离s采用 Pclab 生物信号采集处理系统给刺激电极施加一电刺激信号电压 1V波宽 0.1ms并同时记录输入电极产生的电信号得到从近心端电极传到远心端电极所需时间t重复电刺激 3 次每次间隔 1 分钟取平均值计算其传导速度 v=s/t Tab 3 Change of nerve conduction velocity in experimental
12、 rats (s ) Nerve conduction velocitym/s Group Dose (g/kg) n First month after administration Second month after administration Third month after administration control 10 32.253.16 30.483.80 29.424.23 DM 11 25.682.39# 25.535.77# 21.803.08# TFP (low) 0.63 11 25.554.67# 26.025.60# 26.693.73#* TFP (mid
13、dle) 1.26 12 27.763.30# 26.684.11# 27.065.13* TFP (high) 2.52 11 27.865.89 27.273.49 30.129.44* Methycobal 0.27mg/kg 10 27.351.89# 25.716.30 24.321.79#* Compared with control group #P0.05#P0.01compared with DM group *P0.05 * *P0.05 2.4 大鼠坐骨神经血流量的测定 大鼠用 0.35% 戊巴比妥钠麻醉后暴露坐骨神经中段将 PF3 多普勒血流测定仪的探头置于神经上测定坐
14、骨神经血流量 Tab.4 Effect of TFP on the blood flow in sciatic nerve in experimental rats (s) Group Dose (g/kg) n Blood flow Control 10 19.82.9 DM 11 13.02.4# TFP(low) 0.63 11 12.43.2# TFP(middle) 1.26 12 13.71.4# TFP(high) 2.52 11 28.024.9 Methycobal 0.27mg/kg 10 14.52.6# Compared with control group #P0.0
15、5#P0.01 2.5 糖尿病大鼠坐骨神经中山梨醇含量的测定3 4 样品处理大鼠断头处死取坐骨神经称重以 2 . 0 ml 蒸馏水制备匀浆离心上清液煮沸20 min后冷却加入预冷的无水乙醇至终浓度为 70%沉淀蛋白离心取上清液以氮气流吹干加入 100 mg/ml 对硝基苯甲酰氯的吡啶溶液 200 l于 40水浴中反应 30 min加入一滴水以停止反应精密加入 2.0 ml 氯仿然后分别以 2 ml 5%碳酸钠溶液和 3 ml 1M盐酸溶液洗涤离心留取氯仿层取 20l 注入液相色谱仪 色谱条件 用硅胶为填充剂 正己烷- 氯仿- 乙腈 10 3 1.9 为流动相 紫外检测波长为 260 nm流速为
16、 1.0 ml/min进样量为 20l Tab.5 Effct of TFP on content of sorbitol in sciatic nerve of experimental rats (s) Group Dose ( g/kg ) n Content of sorbitol (g/g nerve ) Control 10 4.912.91 DM 11 262.0791.04# TFP(low) 0.63 11 4.482.23* TFP(middle) 1.26 12 15.638.13#* TFP(high) 2.52 11 11.419.44* Methycobal 0.27mg/kg 10 8.996.01* Compared with control group # P0.05 #P0.01compared with DM group *P0.05 *P0.01 2.6 大鼠脑
