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1、第六章第六章 凝胶层析凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则分子筛色谱（凝胶过滤）分子筛色谱（凝胶过滤）Gel filtration chromatography层析法所用的凝胶颗粒大小要均一，颗粒內外贯穿许多小孔径的通路，分子量小的物质，比较容易进入颗粒中，因此被延滞流出。对凝胶过滤介质的要求对凝胶过滤介质的要求亲亲水水性性高高，表表面面
2、惰惰性性，即即介介质质与与溶溶质质之之间间不不发生任何化学或物理相互作用；发生任何化学或物理相互作用；稳稳定定性性强强，在在较较宽宽的的pH和和离离子子强强度度范范围围以以及及化学试剂中保持稳定，使用寿命长，化学试剂中保持稳定，使用寿命长，具有一定的孔径分布范围；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。 l凝胶特性参数l内水体积内水体积Vi：孔体积孔体积l外水体积外水体积Vo：颗粒间体积颗粒间体积l柱床体积柱床体积Vt Vt=Vo+Vi+ Vg Vt= Vi+Vol洗脱体积洗脱体积Ve Ve=Vo+KdVi lKd=(Ve-Vo)
3、/ViA：“全排阻全排阻”， 流经体积流经体积Vo Kd=0C：“全渗入全渗入”， 流经体积流经体积Vo+Vi Kd=1B：“部分排阻部分排阻”或或 Ve=Vo+KdVi 0 Kd1Kd=(Ve-Vo)/Vi “排阻系数排阻系数” 或或“分配系数分配系数”一定规格凝胶，一定规格凝胶， Kd特征常数特征常数Kd1 物质分子与凝胶之间有吸附物质分子与凝胶之间有吸附 Tyr=1.4 G-25小分子小分子Kd1 水合作用水合作用 NaCl 0.8 G 0.9整个凝胶作为固定相整个凝胶作为固定相 Vi+VgKav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)=KdVi/(Vt-Vo) 有效分配系数有效分配系数分子形状
4、不同分子形状不同M相近也可分开相近也可分开牛血清白蛋白（球）、兔血红蛋白（棍）牛血清白蛋白（球）、兔血红蛋白（棍） 68000d凝胶特性参数排阻极限（排阻极限（exclusion limit）l是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如相对分子质量。例如Sephadex G50的排阻极的排阻极限是限是30 kD。分级范围（分级范围（fractionation range）l能被凝胶阻滞并且能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离相互之间可以得到分离的的溶质的相对分子质量范围。溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50的的分级范围为分级范围为
5、1.530 kD。 凝胶粒径凝胶粒径l凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。影响。粒径越小，分离效率越高。粒径越小，分离效率越高。凝胶粒径多凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50150 m（100200目），例如，目），例如，Sepharose和和Sephadex凝胶粒径分布为凝胶粒径分布为45165 m 。l硬凝胶粒径较小，一般为硬凝胶粒径较小，一般为550 m 。床体积（床体积（bed volume）l即即1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G
6、50的床体积为的床体积为911 cm3/g干胶。干胶。空隙体积（空隙体积（void volume）l即即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为为2000 kD的水溶性蓝色葡聚糖的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。）。l对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。GFC的优
7、点的优点溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用可采用恒定洗脱恒定洗脱法洗脱展开，操作法洗脱展开，操作条件温和条件温和，产品收率可接近产品收率可接近100；每批分离操作结束后每批分离操作结束后不需要不需要进行介质的进行介质的再生再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；故容易实施循环操作，提高产品纯度；作为脱盐手段，作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；高；分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。G
8、FC的不足之处的不足之处仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分离较慢、需严格离较慢、需严格控制流速控制流速；经经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交换和亲和色谱等）后使用。换和亲和色谱等）后使用。凝胶的结构和性质凝胶的结构和性质l葡聚糖系葡聚糖系l其中其中Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。之一，目前仍被广泛使用。Sephadex G是利是利用葡聚糖（右旋糖酐）交联制备的，交联剂一用葡聚糖（右
9、旋糖酐）交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷般采用环氧氯丙烷。Sephadex凝胶按交联度凝胶按交联度大小，分大小，分G 10G 200共八种型号。共八种型号。G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水吸水量量（g/g干凝干凝胶）胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作工作范围范围（肽（肽与蛋与蛋白）白）D700150050001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000 性质性质性质性质1.1.对稀酸、稀碱、盐溶液稳定对稀酸、稀碱、盐溶液稳定对稀酸、稀碱、盐溶液稳定对稀酸、稀碱
10、、盐溶液稳定2.2.2.2.湿态的葡聚糖可加热到湿态的葡聚糖可加热到湿态的葡聚糖可加热到湿态的葡聚糖可加热到110110，干的则能耐受，干的则能耐受，干的则能耐受，干的则能耐受120120高温高温高温高温3.3. 交联度交联度交联度交联度 稳定性稳定性稳定性稳定性 4.4. 凝胶含少量羧基，对阳离子轻微吸附，操作时使凝胶含少量羧基，对阳离子轻微吸附，操作时使凝胶含少量羧基，对阳离子轻微吸附，操作时使凝胶含少量羧基，对阳离子轻微吸附，操作时使I I0.02mol/l0.02mol/l5.5. 芳香族、杂环化合物有时芳香族、杂环化合物有时芳香族、杂环化合物有时芳香族、杂环化合物有时KdKd1 1
11、6.6. 新凝胶柱非特异性吸附蛋白，先用廉价较惰性蛋新凝胶柱非特异性吸附蛋白，先用廉价较惰性蛋新凝胶柱非特异性吸附蛋白，先用廉价较惰性蛋新凝胶柱非特异性吸附蛋白，先用廉价较惰性蛋白饱和吸附、洗涤白饱和吸附、洗涤白饱和吸附、洗涤白饱和吸附、洗涤l规格编号规格编号 间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限 G-50 分离限分离限1500-30000 G-150：5000-400000 对蛋白、多糖分离范围不同对蛋白、多糖分离范围不同 （多糖分子体积比相同（多糖分子体积比相同M的蛋白大）的蛋白大） 粒度：直径粒度：直径100-300um粗粒粗粒 20-80um细粒细粒 40-
12、120um中粒中粒l保存保存 湿法：悬浮于水、缓冲液中，湿法：悬浮于水、缓冲液中，0.02%NaN3，0-5 干法：乙醇分步处理（干法：乙醇分步处理（20%，40%，60%，80%） 脱水收缩，抽滤，脱水收缩，抽滤，60-80 吹干，室温吹干，室温 半缩法：半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，乙醇悬液，封口，4 修饰葡聚糖凝胶修饰葡聚糖凝胶l亲脂性亲脂性 引入有机基团引入有机基团 Sephadex LH-20（羟丙基）（原羟丙基）（原Sephadex G-25） 流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂氯仿、四氯仿、四氢呋喃氢呋喃，因此因此适
13、用于非水溶性溶质的凝胶过滤适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂 引入引入CM-，DEAE-，离子交换、离子交换、 分子筛分子筛 人工合成凝胶，控制人工合成凝胶，控制凝胶总浓度凝胶总浓度和和交联剂交联剂的用量可制成各种型的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。商品名为商品名为Bio-GelBio-Gel，型号从型号从P-2P-2至至P-300P-300共共1010种种（ 数字数字X1000X1000就就相当于该凝胶的排阻限度）相当于该凝胶的排阻限度） 特点：化学稳定性好特点：化学稳定性好pH2-11pH2-11， 无非特
14、异性吸附，无非特异性吸附， 不为微生物利用不为微生物利用粒度：粗粒度：粗150-300150-300um um 中中75-15075-150um um 细细40-7540-75um um 极细极细4040umum聚丙烯酰胺凝胶 是由是由是由是由海藻多糖海藻多糖海藻多糖海藻多糖琼脂中分离出来的天然凝胶，琼脂中分离出来的天然凝胶，琼脂中分离出来的天然凝胶，琼脂中分离出来的天然凝胶， 常见的有常见的有常见的有常见的有Sepharose Sepharose （ SepharoseSepharose 2B 2B、4B4B、6B6B，数字代表数字代表数字代表数字代表 干胶的百分比干胶的百分比干胶的百分比干
15、胶的百分比 ）Bio-Gel-ABio-Gel-A（美国）美国）美国）美国）等等等等 （Bio-Gel-A Bio-Gel-A 0.5M0.5M、1.5M1.5M、5M5M、15M15M、50M50M、150150MM， 数字数字数字数字X10X1066代表排代表排代表排代表排阻限度。阻限度。阻限度。阻限度。骨架各线性分子间以氢键相连，骨架各线性分子间以氢键相连，骨架各线性分子间以氢键相连，骨架各线性分子间以氢键相连，孔径依赖于浓度孔径依赖于浓度孔径依赖于浓度孔径依赖于浓度琼脂糖凝胶 特点特点： 1.化学稳定性差，化学稳定性差，pH4-9 2.脱水、干燥、冷冻、有机溶剂、脱水、干燥、冷冻、有机
16、溶剂、温度高于温度高于40便融化便融化 3.与硼酸形成配合物，孔径变化，避免与硼酸形成配合物，孔径变化，避免 4.强度低强度低，随凝胶浓度，随凝胶浓度而而，弹性小，调整柱压，弹性小，调整柱压 5.非特异性吸附力葡聚糖，非特异性吸附力葡聚糖，I0.01mol/l无明显吸附无明显吸附 6.分离的分离的M范围大范围大（108），随凝胶浓度），随凝胶浓度而而 l架桥琼脂糖凝胶架桥琼脂糖凝胶 Sepharose CL 1，3-二溴丙醇二溴丙醇交联交联，孔径均匀，孔径均匀，孔径大小和分离范围孔径大小和分离范围与普通与普通琼脂糖琼脂糖一样，但一样，但机械强度机械强度，热稳定性，热稳定性，化学，化学稳定性稳定
17、性（pH3-14） l超胶（超胶（ultro-gel ACA) 琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶 比比Sepharose 化学稳定性好，强度高，化学稳定性好，强度高，pH3-10，热稳定性不变热稳定性不变 ACA 34：丙烯酰胺丙烯酰胺3%，琼脂糖，琼脂糖4% 分离范围：生物胶分离范围：生物胶P超胶琼脂糖超胶琼脂糖多孔玻璃微珠多孔玻璃微珠 Bio-Glas 500 孔径孔径500 将多孔硅酸盐玻璃加工制得，粉末状，可粘合将多孔硅酸盐玻璃加工制得，粉末状，可粘合 特点特点：化学稳定性高，强度大，耐高压，：化学稳定性高，强度大，耐高压， 对糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡钝
18、化对糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡钝化实验操作实验操作实验操作实验操作凝胶介质的选择凝胶介质的选择凝胶介质的选择凝胶介质的选择 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，其分将样品中的大分子物质与小分子物质分开，其分离策略离策略是是使高分子物质完全使高分子物质完全被排阻被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。小分子物质完全渗入凝胶内。类分离一般选用类分离一般选用SephadexSephadexG-25G-25蛋白脱盐蛋白脱盐（分子量范围（分子量范围1000-1000-50005000）或选用）或选用G-50G-50。对于小肽和低分子量的物质的脱盐可选用对于小肽和低分子量的物质的脱盐可选用Sephade
19、xSephadexG-10G-10、G-15G-15（分子量范围分子量范围 -1500-1500）、Bio-GelP-2Bio-GelP-2或或P-P-4 4类分离凝胶介质的选择凝胶介质的选择凝胶介质的选择凝胶介质的选择将样品中一些分子量比较接近的物质分开，将样品中一些分子量比较接近的物质分开，该策略是该策略是使使MM尽量在分离范围的两侧尽量在分离范围的两侧 3 3个组分：个组分： Kd Kd 0 0.5 10 0.5 1在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。内部，但由于深入凝胶空
20、隙程度上的差异，最后得到分离。分离血清蛋白可用分离血清蛋白可用G200 5000-800000 G200 5000-800000 强度低强度低 或或G150 5000-400000G150 5000-400000分级分离l粒度的选择粒度的选择 细粒：流速低，洗脱峰窄，分辨率高，精制或分析细粒：流速低，洗脱峰窄，分辨率高，精制或分析 粗粒：粗粒： 用于粗制、脱盐用于粗制、脱盐 凝胶的预处理凝胶的预处理 将干胶颗粒悬浮于将干胶颗粒悬浮于10倍以上吸液量的蒸馏水或倍以上吸液量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在沸水浴沸水浴5小时即可达到凝胶的充分
21、溶胀。小时即可达到凝胶的充分溶胀。 加热法既可节省时间又可加热法既可节省时间又可排气排气、消毒。、消毒。 商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡 不需溶胀不需溶胀l层析柱的选择层析柱的选择 柱比：长度柱比：长度/直径、直径、 体积体积 类分离：类分离： 柱床体积为样品体积柱床体积为样品体积5倍倍或略多或略多 柱比柱比5:1-10:1 分级分离：分级分离：25-100倍倍 柱比柱比25-100 大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高 实验室用的层析柱工业用的层析柱 装柱装柱 1.1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，装
22、柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱后，打开柱的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出水口。水口。 不能出现分层、倾斜、气泡不能出现分层、倾斜、气泡 凝胶柱的平衡凝胶柱的平衡 通过通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一
23、片滤纸或尼龙滤然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，布，以防加样时凝胶被冲起以防加样时凝胶被冲起，并始终保，并始终保持凝胶上端有一段液体。持凝胶上端有一段液体。 上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，这样洗脱进行分级分离时，样品溶液的体积要小，这样洗脱出的峰形好，出的峰形好，蛋白类浓度蛋白类浓度蛋白类浓度蛋白类浓度4%4%l洗脱洗脱 用水、缓冲液、水用水、缓冲液、水-甲醇、水甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸丙酮、氨水、醋酸 温度
24、、流速、柱压、阻力恒定温度、流速、柱压、阻力恒定 防止非特异性吸附防止非特异性吸附 操作压操作压流速快，峰宽流速快，峰宽 相当大柱压范围内相当大柱压范围内 v=KP/L 相同操作压，编号小，交联度大，颗粒粗，流速大相同操作压，编号小，交联度大，颗粒粗，流速大 部分收集器部分收集器部分收集器返回自动馏分收集仪（进口）l再生再生 重复使用重复使用 流速下降、板结可反冲，取出漂洗流速下降、板结可反冲，取出漂洗l凝胶床的检查和维护凝胶床的检查和维护使用时间过长、流速过大、柱高过大，流速使用时间过长、流速过大、柱高过大，流速 控制操作压：柱进出口液位差控制操作压：柱进出口液位差凝胶的保存：凝胶的保存：0
25、.02%叠氮钠或叠氮钠或0.002%洗必泰洗必泰返回蠕动泵核酸蛋白检测仪返回记录仪返回国产柱层析系统伯乐公司（BIO-RAD）柱层析系统注意事项注意事项1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损。）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免压紧凝胶。操作压下装柱，流速不宜过快，避免压紧凝胶。3）始始终终保保持持柱柱内内液液面面高高于于凝凝胶胶表表面面，否否则则凝凝胶胶混混入入大大量气泡，影响液体在柱内的流动。量气泡，影响液体在柱内的流动。应用应用l生物大分子溶液的
26、脱盐生物大分子溶液的脱盐 用用 大粒度、高交联度凝胶大粒度、高交联度凝胶 使蛋白使蛋白Kd=0，盐类盐类Kd=1 蛋白脱盐后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀盐蛋白脱盐后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀盐（易挥发盐）洗脱，真空干燥（易挥发盐）洗脱，真空干燥 样品体积样品体积Vi/3 l去热原去热原 Sephadex G-25 氨基酸氨基酸 Kd=1 热原热原Kd=0 样品体积样品体积 30%Vt分离纯化分离纯化lGFC可用于相对分子质量从几百到可用于相对分子质量从几百到106 数量级的物质的分离纯化。数量级的物质的分离纯化。 G-50除去结晶胰岛素中前胰岛素、大分子抗原除去结晶胰岛素中前胰岛素、大分子抗
27、原 G-25除去青霉素中抗原性杂质、致敏、高分子除去青霉素中抗原性杂质、致敏、高分子杂质杂质 l右图是一例利右图是一例利 用高效用高效GFC分离骨髓分离骨髓 血清蛋白质的结果。血清蛋白质的结果。 色谱柱： 10300，Superose 6洗脱液：0.05molL磷酸盐0.15molL NaCl（pH7.0）流量：0.2mlmin1.IgA高聚体 2. IgA二聚体 3.IgA单体 4.IgG 5.白蛋白相对分子质量的测定相对分子质量的测定l在凝胶过滤介质的分级范围内在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成正
28、比成正比，所以，所以GFC可用于未知物质相对分子可用于未知物质相对分子质量的测定。质量的测定。lGFC仅对球形分子的测量精度较高，对分子仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。 已知分子量的标准品已知分子量的标准品 测未知分子量测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。凝胶柱凝胶柱洗脱体积洗脱体积分子量的对数分子量的对数 2. 2.
29、 2. 2.理化性质鉴定理化性质鉴定理化性质鉴定理化性质鉴定绘制标准曲线绘制标准曲线凝胶层析技术进行测定凝胶层析技术进行测定主要参数测算主要参数测算 Vo通常占柱床通常占柱床30%lVo、Vi1. 重量法重量法 Vt=Vo+Vi+Vg=d2h/4 Vi=gWr g-干胶重量干胶重量 Wr-吸液量吸液量/ g干胶干胶 Vo=Vt-(Vi+Vg) Vg估算为估算为13/g干胶干胶2. 过柱法过柱法 Ve=Vo+KdVi 2106蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖Kd=0 重铬酸钾重铬酸钾 Kd=1 lKd、Kav Kd=(Ve-Vo)/Vi Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 对于特定凝胶对于特定凝胶 ， Kd、Kav是物质特征常数是物质特征常数 对于特定凝胶柱，对于特定凝胶柱， Ve是特征常数是特征常数 可判断各组分分离，预测放大柱床后可判断各组分分离，预测放大柱床后Ve 分辨率分辨率lR=Ve/0.5(WA+WB) R1 完全分开完全分开 VeA=Vo+KdAVi VeB=Vo+KdBVi Ve=Vi(KdB-KdA) 提高分辨率提高分辨率 使使Vi增加即增加柱床体积增加即增加柱床体积 使使(WA+WB) 减小，可浓缩样品，使用细粒凝胶，低流速操减小，可浓缩样品，使用细粒凝胶，低流速操作作
