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1、应用指南 28-9870-45 AA MicroCalTM 非标记相互作用分析采用微量热差示扫描量热技术对治疗性抗体的工艺开发 进行更有效的指导测定pH值和离子浓度对蛋白质稳定性的影响，对于开发的可靠的蛋白质提纯步骤和制剂配方策略来说具有重要的意义。毛细管微量热差示扫描量热法（毛细管DSC）非常适合于提供此类信息，在开发治疗性蛋白质方面具有特别的实用价值。在此讲述的是对用作药物的两种抗体形式（IgG1和IgE）的pH值/离子浓度稳定性的信息采用用微量热差示扫描量热法（DSC）所做的研究。微量热差示扫描量热法（DSC）擅长考察、研究与多结构域蛋白质中不同的单结构域的稳定性，例如抗体。在此可以看到
2、，IgE恒定的结构域片段（Fc）对低酸碱度/高盐分的环境比IgG1 Fc更为敏感。这些结果表明，用于IgG抗体的纯化和制剂策略不适用于IgE的纯化和制剂。该应用指南显示了微量热差示扫描量热法（DSC）是如何用于指导抗体及其他治疗用蛋白质的开发研究的。导言同种型免疫球蛋白特别是人源IgG1的生产和纯化，对于诊断或治疗的应用来说目前已经常规化了。另一方面，基于IgE的疗法最近才刚刚开始兴起（1-3），尚未确定大规模生产、处理和配制IgE或IgE恒定区（Fc）的标准方法。虽然对于IgE的生物化学和免疫调节功能已有较多掌握，但仍未弄清Fc在耐热性或pH敏感度（2）方面是否与Fc相似，也未弄清处理IgG
3、的标准方法是否适用于IgE。IgE对于宿主预防寄生虫和防御性炎症来说是很重要的。然而IgE通过其受体转导信号也是过敏性炎症的一个焦点（4）。IgE的恒定区是一个包含三个 独特Ig折叠区域（C2、C3、C4）重复对的同型二聚体，负责绑定其两个受体即FcRI和CD23（又称FcRII），见图1。本应用指南主要关注微量热差示扫描量热法（DSC）的实用性，用以多方面指导IgG和IgE的生物制剂开发过程。尤其是差示扫描量热法（DSC）对于运输、纯化和配制IgG及制剂药品提供了颇有见地的指导。圆二色光谱（CD）对于此类研究发现的贡献与微量热采用差示扫描量热法（DSC）所能达到的鉴别水平上的比较：微量热差示
4、扫描量热法（DSC）能够在多结构域蛋白质内的单结构域水平上研究蛋白质的稳定性，而这方面圆二色谱获得的数据透明度较低。图1. IgG和IgE的示意图。大分子应用专题85材料与方法 微量热差示扫描量热法（DSC）试验是在MicroCalTM VP-Cap DSC系统上进行的。提纯的Fc、Fc和Fc- C2蛋白质的产生过程如前所述（5）。全套的毛细管DSC试验以不同的酸碱度扫描超过400次，但在四个多月的时间内投入人力很少。只需大约三个工时便可准备好Fc和Fc的试验，包括蛋白质浓度测量、稀释和平板的装调。试验的其余步骤就由MicroCalTM VP-Cap DSC自动完成了。详尽的说明见（5）。结果
5、较宽的酸碱度/盐分稳定性对于多种工业环境亲合蛋白质 纯化法而言，乃是一个先决条件。对极端的酸碱度或盐 分环境耐受性较差，可能会产生聚集体或非功能性蛋白。 Fc对各种酸碱度/盐分环境的耐受性对于确定一个适当 而可扩展的含IgE /Fc蛋白质纯化计划是很重要的信息。 为了研究酸碱度对于Fc的二级结构的影响作用，在 pH 值取4.5至7.4的缓冲液条件下对该蛋白质进行圆二色谱 扫描。 在pH值取5.2和7.4之间，Fc的抗体谱都相同： 包 含一个216与217 nm之间的最小值，表明有重要意义的 折叠和典型的免疫球蛋白IgG结构域。pH值为5时，Fc 抗体谱则向无规卷曲的方向转变（朝200 nm移动
6、最小 值）；而pH值为4.5时，该抗体谱表示该蛋白质主要呈无 规卷曲态（5）。根据pH依存型去折叠，我们研究表明 Fc在pH 7.0和4.5之间其稳定性降低。 当pH值不同时，热变性由远紫外线圆二色谱进行监测。 pH值为7.0时，所有三个结构域（C2-4）的去折叠都发生 在一个转变中。pH值为6.0时，观测到一个同样的转变， 尽管温度明显地下降了1C。在pH值为5.2时Fc的热诱导 去折叠结果导致一个更宽的转变范围峰值温度下降了6。 两种转变仅仅在 pH值为4.8时才显而易见（5）。Fc和Fc的pH依存性去折叠根据最初的圆二色谱结果，利用微量热差示扫描量热法（DSC）开始对Fc和Fc进行详细的
7、pH依存性的稳定性研究。经研究发现：Fc和Fc的去折叠转变均为不可逆，且依赖于扫描速率（数据未显示），表明不可逆的聚集明显地影响到两种蛋白质的转变温度值（6,7）。不同于利用圆二色谱的测定对象，Fc经显示在8.0以下的全部pH值测定中均含有两个独立的去折叠转变（见图2A）。其中之一的转变在低酸碱度和高盐分（氯化钠）的条件下变得不稳定，而另一个转变却没有。温度 (C)温度 (C)图2. 在15 mM氯化钠的条件下，pH依存型差示扫描量热法（DSC）对（A）Fc和（B）Fc的扫描结果。获美国生化及分子生物学会准许复印。根据利用圆二色谱获取的结构数据，涉及对 pH值敏感的转变的结构域在pH为4.5的
8、条件下完全去折叠，显示微量热差示扫描量热法（DSC）不仅对于掌握折叠区域的稳定性很重要，而且对其折叠状态也同样重要。经显示，Fc（来自IgG1）通过两个单独结构域的转变而发生去折叠；低温转变属于C2结构域，高温转变属于C3结构域（图2B）。C2转变通过去糖基化对其耐热性（未公布的结果）的影响作用而得以鉴别，而C3转变则通过其出奇之高的耐热性（8）来确认。两个Fc结构域显示均对pH值和氯化钠敏感。与Fc不同的是，Fc结构域并未实质性地去折叠，直至pH值降到3.0以下，说明为什么抗体需要在pH值低于3.5时从蛋白质A介质中洗脱，以及为什么阳离子交换层析法对IgG是一种适宜的纯化技术（图3）。大分子
9、应用专题86图3.A）Fc和（B）FC结构域耐热性的pH依赖性由其温度值所表明。获美国生化及分子生物学会准许复印。在高盐分的情况下，Fc的C2、C3结构域以及Fc的C3、C4结构域都失去稳定性。我们观察到，相对于介乎5.0、7.0的中间pH值范围的15 mM氯化钠，750 mM氯化钠的Tm值发生了微小的变化（图3A）。这些稳定性的小小差异不太可能对该pH值范围内Fc的体外半衰期产生较大的影响，因为C2和C3结构域的温度仍然在60C以上。借助于微量热差示扫描量热法（DSC）对Fc- C2融合蛋白质进行试验，对pH值敏感的Fc结构域被确定为受体绑定结构域（C3和C4）。Fc- C2和Fc的结构域在
10、pH值为2.5时仍然是稳固地折叠着（图4）。根据如上所述的试验，可知当pH值低于3.0.时Fc结构域实质性地展开去折叠了，这确定了Fc的C2结构域作为对pH值不敏感的结构域。这些结果由pH值为4.5的Fc的有限的蛋白水解结果得以确认（5）。离子强度对于稳定性的影响 温度 (C)在高盐分的条件下，Fc的C2结构域具有略好的热稳定性。在比15 mM氯化钠的量测温度高出7C的条件下，C2在中间pH值和750 mM氯化钠溶液中作了特别的稳定化处理（图3B）。相比之下，当5pH6时，氯化钠有效地对C3C4结构域去稳定化（图3B）。在低盐分并且pH取值5.0的条件下，C3C4开始展开。在高盐分条件下，去折
11、叠转变上移0.5个pH值单位，达到pH 5.5，排除了阳离子交换层析作为纯化IgE或含Fc蛋白质步骤的可行性。图4. 微量热差示扫描量热法（DSC）对Fc（蓝线）和Fc- C2（红线）的扫描图，利用比照pH值为2.5的同一磷酸盐缓冲液的透析样品作参比。 差示扫描量热法（DSC）曲线上方的是Fc和Fc- C2蛋白质的示意图。获美国生化及分子生物学会准许，复印自（5）。结论在本研究中，Fc显示了不寻常的pH敏感性，它会导致比Fc观测值高出2个pH值单位（即pH= 5.0）绑定受体的结构域能够去折叠。借助微量热差示扫描量热法（DSC）确定的Fc的pH值/盐敏感性实验提供了对选择基于IgE蛋白质的纯化策略、装填程序和制剂配方来说很重要的信息，并表明无法用IgG的标准方法进行处理。Fc的pH值稳定性数据也意味着在标准的亲和纯化过程（例如最常见的对蛋白A介质的纯化策略）中IgG随时间变化的一个聚集的合理机制，该纯化包括低pH值的洗脱和保持步骤。鸣谢本应用指南由加州圣地亚哥Biogen Idec的Stephen Demarest博士友情提供。参考文献大分子应用专题87
