生物大分子结构与功能复习题

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1、 生物大分子结构与功能复习重点整理生物大分子结构与功能复习重点整理 第一部分第一部分 核酸化学核酸化学 1.运用基因工程的方法， 现在科学家们已经可以在大肠杆菌中表达具有特定医学运用基因工程的方法， 现在科学家们已经可以在大肠杆菌中表达具有特定医学用途的蛋白质，如胰岛素、生长激素等。假如你想在大肠杆菌中大量表达某一用途的蛋白质，如胰岛素、生长激素等。假如你想在大肠杆菌中大量表达某一人的基因产物，可能会面临哪些问题？人的基因产物，可能会面临哪些问题？ 大肠杆菌是原核系统，目标产物是哺乳动物真核细胞的产物。首先，目的基因不能有内含子。 一要有合适的表达载体。 质粒能够好的复制转录表达载体要有合适的

2、功能元件帮助 cDNA 转录翻译，比如 CMV 启动子，IRIS（核糖体进入位点）等有抗性位点能与宿主菌基因型匹配适合在合适的宿主菌中生长。有 tag 方便产物的分离纯化。 二要有合适基因型的大肠杆菌。要能大量增殖，稀释外源蛋白表达时的能荷转录，宿主与质粒基因型可匹配，有相应的转录辅助因子，比如 rosetta 菌翻译，可以匹配人源的密码子偏好性翻译后，能够对蛋白进行正确折叠，糖基修饰，加肽 。对固醇类或其他分子也要改造宿主基因型 使其核实表达。 三要有合适的诱导环境。 2.甘油醛甘油醛-3-磷酸脱氢酶（磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas

3、e，GAPDH）的序列是已知的，你用什么方法和技术可以确定其的序列是已知的，你用什么方法和技术可以确定其在染色体上的位置和大小？在染色体上的位置和大小？ （1）FISH 法法。用已知的标记 DAPI、PI 的单链核苷酸为探针，按照碱基互补配对原则对待测材料中的单链核酸进行特异性结合，再用荧光显微镜示踪。 Step1 标本变性 4%PFA + 探针变性 Step2 杂交洗脱-信号放大-封片-荧光镜检 （2）RFLP 法法 Step1 片段用酶切碎 跑胶分离 DNA 限制性片段-Southern blot DNA 转膜 Step2 DNA 与加了标记的核酸探针杂交-洗膜显影-细胞图谱与物理图谱，遗

4、传图谱关联比对。 3.为什么人体细胞在进行有限的细胞分裂之后将停止分裂？若它们持续分裂将为什么人体细胞在进行有限的细胞分裂之后将停止分裂？若它们持续分裂将发生什么？癌细胞为什么会持续分裂下去？发生什么？癌细胞为什么会持续分裂下去？ （1）理论一端粒学说）理论一端粒学说 端粒是真核生物染色体末端由许多简单重复序列和相关蛋白组成的复合结构， 具有维持染色体结构完整性和解决其末端复制难题的作用。随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发生凋亡（apoptosis） 。端粒的长度决定细胞的寿命，因此可用失去的端粒数来“计数

5、”细胞分裂的次数，端粒被形象地称之为分子钟（molecular clock）或有丝分裂钟（mitotic clock） 。 绝大多数恶性肿瘤细胞反常地重新出现端粒酶的活性， 发挥其合成端粒的功能，补尝正常的端粒丢失，端粒将不能达到临界长度。如此，这个细胞就不能进入正常的老化和衰亡，从而获得了“永生性” （immortality） 。这样，一个恶性增殖的肿瘤细胞克隆便宜告形成 （2）理论二细胞周期调控学说）理论二细胞周期调控学说 不同细胞周期阶段的的长度是由内外部化学信号精确调控的细胞周期之间的转换受“检测点”调控。Cyclin 和 cyclin 依赖激酶 CDK ，共同作用。肿瘤细胞中，细胞周

6、期检测点通常不受控制，这种不受控制是由于控制 cyclin/CDK复合物浓度机制的遗传缺陷造成的。编码 cyclin/CDK 复合物的基因突变或，响应蛋白突变导致癌症发生 4.人类基因组计划完成后，发现其中仅有人类基因组计划完成后，发现其中仅有 25000 种编码基因，约占种编码基因，约占 99%的序列的序列都是不编码的。有人说这些不编码序列是垃圾序列，你怎么理解这些非编码序都是不编码的。有人说这些不编码序列是垃圾序列，你怎么理解这些非编码序列？它们有功能吗？列？它们有功能吗？ 对于目前发现的“非编码序列” 。有些是真的“非编码” ，有些其实是编码一些功能未知的短肽，但是常常被误认，现在成为新

7、的研究热点。 5.研究发现人研究发现人 miR-124 可能直接作用与可能直接作用与 CDK4 而抑制膀胱癌的生长。请设计一而抑制膀胱癌的生长。请设计一个实验，以证明上述假设是正确的。个实验，以证明上述假设是正确的。 （1） 通过生物信息学手段查找 mirRBASE 数据库找到 mir124 的种子序列及在 CDK 3UTR 的靶位点。 （2）设计引物用 PCR 法从基因组 DNA 中克隆所需的 CDK 3UTR，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。 构建成报告基因(reporter gene)质粒。 mir124 加入穿梭载体（真核原核穿梭载体） （3）筛选阳性克隆

8、，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。 （4）扩增 mir124 质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。 （5）培养 293(或其它目的细胞)，并接种于 24 孔板中，生长 10-24 小时(80%汇合度)。 （6）将 pGL3-basicCDK 3UTR 质粒与 mir124 表达质粒共转染细胞。 （7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。 （8）加入底物，测定荧光素酶的活性。 （9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较。 6.何谓反转录病毒、反转录病毒样元件和反转座子？它们在结构上有何异同？何谓反转录病毒、反转录病毒样元件和反转座子？它们在结构上有何异同？ 反转录病毒：包含反转录酶整合酶和

9、 RNA，可以在宿主体内逆转录为 DNA并整合在宿主 D 染色体内的一种病毒，如 HIV。反转录病毒样元件：类似于反转录病毒的 DNA 元件，具有转座子的效应，如酵母 Ty1。反转座子：从多聚腺苷酸 RNA 反转录成 DNA 的元件，具有转座子效应，如果蝇 F.G 元件。 结构上的异同结构上的异同：反转录病毒本身为 RNA 和蛋白质的病毒类元件，而另外两种都是 DNA 元件；反转录病毒 RNA 与反转录病毒类元件的结构上大致一致，都具有 LTRs，但反转录病毒包含 env 基因（编码病毒蛋白成分）而反转录病毒元件没有；反转录子末端没有 LRTs，但这类元件的一端都是纯的 A:T 碱基对构成。

10、7.操纵子的结构有什么特点？为什操纵子的结构有什么特点？为什么操纵子在原核生物中存在， 而在真核生物中么操纵子在原核生物中存在， 而在真核生物中不存在？不存在？ 操纵子（operon） ：指包含结构基因、操纵基因以及启动基因的一些相邻基因组成的 DNA 片段，其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。 结构特点：操纵子通常由 2 个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。 操纵子是负调控的方式， 每个基因都需要阻遏蛋白。 真核生物的基因组很大，基因很多，如果采用负调控需要合成大量的阻遏蛋白，不经济。因此真核生物多采用正调控的方式。 8. 一般认为，突变在进化中发挥

11、着重要的作用。请问，哪种进化不伴随一般认为，突变在进化中发挥着重要的作用。请问，哪种进化不伴随突变？突变？ 没有突变不影响进化 突变是进化之源。 9.什么样的染色体有利于基因表达？如何检测基因表达活性？什么样的染色体有利于基因表达？如何检测基因表达活性？ （一）对染色体的要求 （1）结构完整的 如果片段缺失了，就无法表达；如果基因突变，也会影响表达 （2）结构疏松的 比如灯刷染色体 。要有开放的疏松的染色体区域，如疏松泡 （3）结构修饰适合的 启动子区甲基化影响表达；组蛋白修饰影响；多梳蛋白抑制表达；没有被Xist 基因沉默的 （二）表达活性的检测方法 （1）DnaseI 消化染色体，看染色体

12、活跃度 （2）RT-PCR 看 ct 值 （3）Western blot 看灰度 第第二二部分部分 蛋白质化学蛋白质化学 1.蛋白质纯化总原则与主要技术？蛋白质纯化总原则与主要技术？ 总原则：总原则：以合理的效率(Efficiency), 速度(Speed), 收率(Yield)和纯度(Purity) ，将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是杂蛋白中分离出来，并保留其生物学活性和化学完整性。 主要技术：主要技术： 分子量大小：透析、超滤、凝胶过滤、超速离心； 形状：形状的不同会影响蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动的速度。 主要包括： 密度梯度离心、 蛋白电

13、泳； 电荷：电荷不同蛋白质在电场中的移动速度、方向不同。包括：等电聚焦电泳、双向凝胶电泳、离子交换层析； 溶解度： 蛋白质分子表面的亲水性和疏水性带电基团差异导致其在溶剂中的溶解度不同。通过改变 pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。包括：盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法； 配体特异性结合： 生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合，这种结合是特异的又是可逆的，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上， 利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。包括：亲和层析（免疫亲和层析、生物亲和层析、金属

14、螯合亲和层析） ； 吸附性质：疏水层析，基础是蛋白质的疏水性差异。利用固定相上偶联的疏水性配基与流动相中的疏水分子发生可逆性结合而进行分离。反向层析，基础为蛋白质的极性差异。流动相的极性大于固定相的层析技术。蛋白分子在该系统中的移动速度依其极性排列，极性大者移动快。 变性和复性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。 当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。如，包涵体蛋白的变性纯化与复性。 2.不同的亲和层析标签有何特点，如何选择？不同的亲和层析标签有何特点，如何选择？ （1）特点）特点 His6：6 个连续组氨酸， 优点：标签分子量

15、小，一般不影响目标蛋白的功能；可用于变性/非变性纯化；可用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 互作研究；免疫原性较低，可直接用于抗体制备；可应用于多种表达系统，纯化条件温和；可和其它亲和标签共同构建双亲和标签。缺点：融合蛋白易形成包涵体；包涵体蛋白难于溶解；融合蛋白溶解后不能正确复性；层析时螯和的金属离子容易泄漏；非特异性结合会造成制品纯度不高。 GST：谷胱甘肽转移酶，最早使用的亲和标签。目标蛋白加于 GST 的 C端，再利用谷胱甘肽亲和介质进行纯化，或固定在亲和介质上进行蛋白质-蛋白质互作研究。因 GST 分子量较大，且以二聚体的形式存在，一般都需要去除融合标签。此系统必须依赖于 GST 的

16、正确折叠。GST 融合蛋白常用来免疫动物生产抗体，及作为载体蛋白进行蛋白结晶。 CBD：几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain)，NEB IMPACT 系统以几丁质结合肽为融合标签，融合蛋白可用几丁质亲和层析纯化，利用内含肽（intein）特异性原位剪切直接获得目标蛋白。 最大优点：不需使用蛋白酶来去除融合标签。 MBP：麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein)，此系统使用交联直链淀粉的亲和介质纯化，用麦芽糖进行竞争性洗脱。 优点：MBP 无半胱氨酸残基，不干扰目标蛋白形成正确二硫键；使用的介质价格低廉；可在温和条件下洗脱融合蛋白；加上其分泌信号，可以进行分泌表达在细胞周质；这一系统最显著的特点是可改善目标蛋白的溶解性，促进正确折叠，提高活性蛋白的回收率。 Biotinated peptide： 生物素化多肽链， 生物素-抗生物素蛋白 （Avidin-