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1、D O I:1 0. 3 7 2 4/S P. J . 1 0 9 6. 2 0 1 1. 0 1 0 6 1 9固相萃取-高效液相色谱法同时检测畜禽粪便中1 4种兽药抗生素李艳霞* 李 帷2 张雪莲1 杨 明11(北京师范大学环境学院水环境模拟国家重点实验室,北京 100875)2( 环境保护部核与辐射安全中心, 北京 100082)摘 要 研究并优化了同时分析畜禽粪便中 14 种抗生素(四环素、 磺胺、 氟喹诺酮和大环内酯类)的加速溶剂萃取参数、 固相富集净化程序、 以及高效液相色谱分离和检测条件。结果表明, 以 1% 乙酸( pH 2.6) 作为流动相, 在 270 nm 的检测波长下,
2、 14 种抗生素能达到基线分离。3 倍信噪比下, 四环素、 磺胺、 氟喹诺酮和大环内酯类抗生素的检出限分别为 3590, 1228, 917 及 19 mg/kg。加标浓度在 1 和 10 mg/g 时, 畜禽粪便样品经过 50% 甲醇的柠檬酸盐缓冲溶液提取, HLB 固相萃取柱富集净化后, 四环素、 磺胺、 氟喹诺酮和大环内酯类抗生素的回收率分别达到了 58%75% 和 66%83% , 74%93% 和 91%101% , 74%80% 和 80%88% ,85% 和 68% , 相对标准偏差分别为 6.2%10.7% 和 7.8%13.6, 2.6%10.2% 和 4.4%13.2% ,
3、 6.1%12.5%和 8.3%14.6% , 10.6% 和 12.3% 。采用此方法对辽宁省部分规模化养殖场的猪粪、 牛粪和鸡粪样品进行了检测。4 类抗生素都有检出, 浓度范围分别为 0.7522.34, 0.101.71, 0.384.46 mg/kg 和 0.230.35 mg/kg。关键词 畜禽粪便; 抗生素; 固相萃取; 高效液相色谱2011-06-13 收稿; 2011-10-09 接受 本文系国家自然科学基金项目 (No.20977010), 环保公益性行业科研专项项目(No.200909042)和水体污染控制与治理技术重大专项项目 ( No.2008ZX07209-007)
4、资助 *E-Mail: 1 引 言从 20 世纪 50 年代起, 抗生素在畜禽养殖业中开始被普遍使用1, 其主要用途包括动物疾病治疗、 动物生长调节剂以及提高饲料利用效率等2。抗生素作为药物和非药物对畜禽养殖业的发展起到重要作用, 在很多国家的使用量也在不断增加, 以美国为例, 集约化养殖场抗生素的使用量约占其抗生素年生产量的 80%3。大多数抗生素在动物体内吸收性差, 30%90% 会以原形药物形式排出体外46。因此, 大量抗生素将随畜禽粪便进入环境, 对地表水、 农田土壤, 甚至地下水造成污染7,8。不同类型的养殖场在动物生长的不同周期使用的抗生素种类不同, 因此, 对粪便中可能残留的多种
5、抗生素同时分析尤为重要。目前, 用于分析抗生素的方法主要有液相串联质谱及高效液相色谱。前者虽然具有更低的灵敏度, 对样品的分离度要求不高, 但是存在较强的基质效应, 尤其是对复杂的粪便样品, 并且仪器的使用及维护成本很高。比较而言, 在满足检出限要求的前提下, 高效液相色谱不仅能实现很好地分离, 准确进行定性和定量分析, 还大大降低了分析成本。目前对粪便中抗生素的检测分析研究中, 普遍按抗生素种类建立检测方法, 不同类别抗生素则需要调整流动相和检测器, 不但加大了工作量, 并且延长了分析时间。为实现多种抗生素同时分析, 本研究优化了固相萃取前处理以及高效液相色谱检测方法, 建立了相对简便、 低
6、成本、 准确的多种抗生素同时分析的方法, 对开展畜禽粪污多种抗生素残留等相关研究具有重要意义。2 实验部分2. 1 仪器与试剂Agilent-1200 高效液相色谱仪( 美国 Agilent 公司) ; ASE300 加速溶剂萃取装置( 美国 Dionex 公司) ;Visiprep TM-DL 固相萃取装置( 美国 Supelco 公司) ; WD-12 氮吹仪( 杭州奥盛仪器有限公司) ; HLB 固相萃取柱( 美国 Waters 公司) 。金霉素( CTC) 、 磺胺胍( SG) 、 磺胺( SA) 、 磺胺甲基嘧啶( SMR) 、 磺胺二甲嘧啶( SMZ) 、 磺胺间甲氧嘧第 40 卷
7、2012 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry第期请提供第一作者的手机号码以方便编辑部和作者联系,此号码不会公布在期刊中;请认真核实参考文献 的作 者,期刊,年,卷,期,起止页码是否正确以及文献 是否与文中一一对应；文献 15是专著还是学位论文？请补充 必要的信息说明。啶( SMM) 、 磺胺氯哒嗪( SCP) 、 恩诺沙星( ENR) 、 双氟沙星( DIF) 和泰乐菌素( TYL) , 购于 Sigma-Aldrich公司; 四环素( TC) 、 土霉素( OTC) 、 诺氟沙星( NOR) 、 环
8、丙沙星( CIP) 和洛美沙星( LOM) 购于中国药品生物制品检定所; 甲醇、 乙腈( 色谱纯,Fisher 公司) ; 柠檬酸、 EDTA 钠盐、 NaOH 等试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水。2. 2 标准溶液配制 准确称取各种抗生素标准品 10 mg, 溶解于 10 mL 棕色容量瓶中。四环素类、 磺胺类和大环内酯类抗生素用甲醇溶解, 氟喹诺酮类抗生素用 0.03 mol/L NaOH 溶解, 储存于 4冰箱中。准确移取各种单标储备液, 用棕色容量瓶配制各种浓度的混合标准液, 待用。2. 3 样品采集及前处理 在辽宁省选取规模化养猪场、 养牛场及养鸡场各 3 家, 采集当天动物排泄的
9、新鲜粪便, 进行多点采样并混合, 约 500 g 作为代表性样品。样品采集后用黑色塑料袋密封, 并立即存放于冰盒中冷藏存放,然后保持冷冻状态下尽快运回实验室, 并进行冷冻干燥处理。冻干后的样品避光保存, 分析前用研钵研磨, 并过 2 mm 筛后进行样品前处理。在畜禽粪便样品中加入抗生素混标溶液, 加标浓度分别设置为 1 和 10 mg/g, 混合均匀后放置 24 h,使药物与样品介质充分接触, 以模拟实际情况。每个处理样品各提取、 分析两次。在 ASE 萃取池中放入滤膜铺垫, 依次准确加入 1 g 样品、 0.5 g 硅藻土和 0.3 g EDTA, 充分混匀。加入提取剂( 50% 甲醇+ 5
10、0% 柠檬酸混合液) 静态提取 5 min, 循环两次。收集提取液, 加水将提取液的甲醇含量稀释到 10% 以下( 防止甲醇浓度过高, 上柱时将目标物带走) 用于净化。SPE 固相萃取柱使用前依次用 5 mL 甲醇和 5 mL 0.2 mol/L 柠檬酸溶液( pH 4) 活化。将以上提取液以 5 mL/min 流速过柱, 依次用 10 mL 5% 甲醇溶液和 10 mL 水冲洗 HLB 小柱, 用 10 mL 二氯甲烷洗脱目标抗生素, 洗脱液在氮气下吹干至 0.1 mL 以下。加入 1 mg 内标物质 LOM, 用甲醇-水混合溶液定容至 1 mL, 待测。2. 4 色谱条件 本研究采用 In
11、ertsil ODS-3 色谱柱( 250 mm4.6 mm, 5 mm, Dikma 公司) ; 流动相为乙腈( A) 和 1% 乙酸( B) , 流速为 0.8 mL/min; 柱温 30; 梯度洗脱程序: 018 min, 10% A; 1820 min, 37% A; 2022 min,80% A; 2225 min, 80% A。3 结果与讨论3. 1 S P E净化过程的优化 畜禽粪便样品基质非常复杂, 含有蛋白质、 碳水化合物、 脂肪和各种无机组分9。样品的净化对目标物的准确定量至关重要。目前, HLB 固相萃取柱是环境样品中抗生素前处理使用最多和效果最佳的柱子10。研究显示,
12、HLB 和 SAX( 阴离子交换柱) 联用对土壤中抗生素的净化效果也非常好1113。但是, 实验发现 HLB 和 SAX 联用使部分抗生素的回收率降低, 可能是 SAX 柱持留了部分的目标物, 而且联用方法使净化步骤成本提高。本实验表明, 单独使用 HLB 柱即可有效净化样品。因此, 净化步骤选择 HLB 小柱。分别以二氯甲烷、 乙酸乙酯、 丙酮、 四氢呋喃和甲醇为洗脱剂, 进行洗脱实验。由于甲醇的强极性和粪便基质的复杂性, 纯甲醇将柱体固定的大量干扰有机物和目标抗生素一起洗脱下来, 使得目标物的出峰被杂质严重掩盖。使用丙酮和甲醇进行洗脱时, 柱体上的深色物质很快被洗脱下来, 说明这两种溶剂的
13、极性还是过强。选择极性略小的二氯甲烷、 乙酸乙酯和四氢呋喃对部分抗生素目标物进行洗脱, 四氢呋喃和乙酸乙酯的洗脱效率明显高于二氯甲烷。但比较而言, 二氯甲烷对金霉素的洗脱效率均好于乙酸乙酯和四氢呋喃, 并且洗脱下来的杂质最少, 色谱图中目标物分离和检测基本不会受到干扰。综合考虑, 选择二氯甲烷作为洗脱剂更为合适。为了将全部目标物充分洗脱下来, 洗脱体积设定为 10 mL。3. 2 检测波长的确定 据相关研究显示, 四环素类抗生素在 268 和 355 nm 附近具有强吸收15, 16; 磺胺类在 270 nm 附近有分 析 化 学第 40 卷强吸收15。所以, 首先选用 270 nm 作为检测
14、波长。采用 270 nm 为检测波长对 4 类抗生素进行检测时发现, 氟喹诺酮类和泰乐菌素也有较好的响应值。在二级阵列检测器上, 设置 270 nm 及附近波长进行多波长检测分析, 结果显示, 270 nm 时 14 种抗生素的响应较强,且分布相对均匀。因而, 本研究选择270 nm 作为分析方法的检测波长。3. 3 流动相的确定抗生素是一类可离子化的极性有机化合物, 因而流动相的 pH 值对抗生素物质的分离和检测非常重要。流动相一般采用有机溶剂和缓冲液按一定比例混合。其中, 最常用的有机溶剂是乙腈和甲醇, 它们的紫外吸收较低。由于乙腈相对于甲醇有更低的吸光度, 洗脱能力更强, 黏度小, 所以
15、在同样的流速下柱效更高、 柱压更低。常添加的缓冲液甲酸、 乙酸、 磷酸和草酸被用于最佳的分离条件的优化。结果表明, 乙酸和草酸作为流动相, 分析物的峰形比较好, 但是梯度洗脱时, 草酸流动相的色谱图基线随流动相比例的变化出现较大的扰动, 影响峰面积的确定。因此采用乙酸作为流动相。对缓冲液 pH 3 时, 随 pH 值的增大, 大部分抗生素物质的峰形变宽、 峰高变小, 保留时间延长。同时, 过低的 pH 值会降低色谱柱使用寿命。因而, 缓冲液的 pH 值控制在 23 范围内。流动相采用 1% 乙酸( pH=2.6) 。3. 4 标准曲线的线性范围、 检出限、 定量限及回收率配制浓度范围在 0.1
16、50 mg/L 的系列混合标准溶液进行测定, 分别以 14 种抗生素与内标物的峰面积之比对浓度作图, 得到各种抗生素目标物的内标曲线。结果显示, 在 0.150 mg/L 浓度范围内标准曲线具有良好的线性, 相关系数r均大于 0.99。仪器的检出限为 3 倍信噪比时的浓度, 仪器定量限为 10 倍信噪比时的浓度, 方法定量限通过仪器定量限和方法回收率计算得到, 具体结果见表 1。除四环素类的 3 种抗生素的定量限高于 100 mg/kg 外,其余抗生素的定量限都满足 100 mg/kg 的测定水平。在 1 及 10 mg/g 两个添加浓度下的回收率, 除了CTC 略偏低( 分别为 58% 和 66% ) , 绝大多数目标物的回收率都在 70%100% 之间。从方法的日内与日间稳定性来看, RSD 基本都在 15% 以内, 重现性良好。表 1 目标抗生素检出限、 定量限及回收率 Table 1 Limits of detection, lim
