《K562细胞中HsamiR196b功能的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《K562细胞中HsamiR196b功能的初步研究（98页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 我国，白血病是常见的恶性肿瘤之一，死亡率大约为2 5 2 1 0 万。根据增生细胞类型，白血病可分为粒细胞性、淋巴细胞性和单核细胞性三类。按白血病细胞分化程度可分为急性及慢性两大类。其中慢性粒细胞性白血病( C h r o n i cm y e l o g e n o u sl e u k e m i a , C M L ) ，居我国慢性白血病发病率之首。C M L 是一种发生在骨髓早期多能造血干细胞上的恶性增生性疾病( 获得性造血干细胞恶性克隆性疾病) 。其主要特征为未成熟分化的早幼粒细胞在骨髓中呈恶性、无限制地增生，并在血液中大量累积。根据临床进展，C M L 的病程可分为慢性期( c
2、h o m cp h a s e ，c P ) ，加速期( a c c e l e r a t e dp h a s e ，A P ) 和急变期( b l a s t耐s i s ，B C ) 。该病进展缓慢，但多数慢性期患者病情可逐步演变，可经过加速期或直接进入急变期。一旦发生急性变，患者的存活期仅有3 “ - - 6 个月。C M L 的发生与费城染色体易位有着很深的联系。费城染色体易位使9 号染色体长臂( 9 q 3 4 ) 上的原癌基因A 睨( c - A B L ) 移位至2 2 号染色体( 2 2 q l1 ) 上的B C R ( B r e a kp o i n tc l u s
3、 t e rr e g i o n ) 断裂点上，重新组合成B C R - A B L 基因。9 0 以上的C M L 中存在P h 染色体。融合基因编码的融合蛋白P 2 1 0 ，具有异常增强的酪氨酸激酶的活性，导致C M L 的发生。P 2 1 0 蛋白能与白细胞介素3 受体1 3 ( i n t e r l e u k i n - 3r e c e p t o rb e t a ) 亚基相互作中文摘要用，通过级联放大的活化作用激活一系列控制细胞周期的蛋白质，从而加快细胞分裂。此外，P 2 1 0 蛋白还抑制D N A 修复，影响基因组的稳定，使其更易产生遗传突变。因此，P 2 1 0 蛋
4、白所具有的增强型酪氨酸激酶活性被普遍认为是引起C M L 的主要原因。m i c r o R N A s ( m i R N A ) 是一类真核生物中普遍存在的长度约为1 8 “ - 2 5 个核苷酸的单链R N A 分子，通过与靶m R N A 3 端非编码区( 3 U T R ) 互补结合在转录后水平抑制靶基因的表达。人类基因组编码约一千余种m i R N A ，它们能够靶向作用于哺乳动物基因组中至少3 0 的编码基因。m i R N A 既可作为抑癌基因，下调原癌基因的活性；也可作为癌基因，下调抑癌基因的活性。不同的细胞类型中，同样的m i R N A 可能作为癌基因或抑癌基因，而且在某
5、类型的细胞中任何一个m i R N A 的靶基因一般不会只有一个，而每一个靶基因又可能和多个m i R N A相互作用，因组成了错综复杂的调控网络，在转录后对各种基因进行复杂的调控，参与肿瘤的发生发展。本课研究通过生物信息学分析寻找能对B C R - A B L 基因进行靶向调控的m i R N A 分子，并进行初步的实验验证。研究内容主要有以下几部分：第一部分：应用T a r g c t S c a n 5 1 生物信息学软件进行预测并得出可能与A 配的m R N A3 U T R 互补结合的m i R N A 。分析结果显示H s a - m i R 1 9 6 b 可能通过与B C R
6、- A B Lm R N A3 U T R 部分结合而抑制其翻译表达。结合检索文献的结果，选择了H s a m i R 1 9 6 b ，对其在C M L 中的功能进行研究。第二部分：针对H s a - m i R 19 6 b 的初始转录产物p n H s a - m i R 1 9 6 b ( 包括前体p r e H s a - m i R 1 9 6 b 及其3 、5 端各约2 0 0 b p 侧翼序列) 设计合成引物。从正常人外周血中提取基因组D N A 作为模板，通过P C R 扩增获得目的基因片段。通过H p aI X h oI 双酶切及T 4 连接酶连接将其插入L e n t i
7、 l o x3 7 ( p L L 3 7 ) 质粒中。通过质粒P C R 及双酶切筛选并鉴定出阳性重组质粒，D N A 测序鉴定其序列的保真性。实验结果表明，成功克隆p n H s a - m i R 1 9 6 b ，并将其正确地插入到p L L - 3 7H硕士学位论文质粒的克隆位点中，获得p L L 3 7 1 9 6 b 表达载体。第三部分：将成功构建的p L L 3 7 - 1 9 6 b 表达载体与慢病毒包装质粒p C M V - d R 8 9 1 、包膜蛋白质粒p C M V - V S V - G 共转染至H E K 2 9 3 F T 细胞中，以包装能表达H s a -
8、m i R 1 9 6 b 的缺陷性慢病毒颗粒。转染7 2 h 后，收集含病毒颗粒的细胞培养基，离心后过滤，获得病毒上清。将病毒上清梯度稀释后感染H E K 2 9 3 F T 细胞，以表达G F P 绿色荧光蛋白的细胞数来计算病毒滴度。应用S Y B RG r e e nI 实时定量P C R 法检测慢病毒载体感染后H E K 2 9 3 F T 细胞中H s a - m i R 1 9 6 b 的表达情况，3 琼脂糖凝胶电泳分析P C R 产物的长度。病毒滴度检测结果为7 3 士1 1 x 1 07 T U m L ，具有较高的感染效率，可用于下一步的研究。实时定量P C R 结果表明，与
9、未感染的细胞相比，受慢病毒载体感染的H E K 2 9 3 F T 细胞中H s a - m i R 1 9 6 b 的表达量提高了近2 2 倍。溶解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果显示P C R 扩增特异，扩增产物的片段长度与预期的一致，说明该表达载体能在细胞内表达出成熟的H s w m i R - 1 9 6 b 。第四部分：以K 5 6 2 细胞为模型，用H s a - m i R - 1 9 6 b 慢病毒载体对其进行感染，同时设阴性对照组与空白对照组。感染后1 2 h ，离心去上清，换入新培养基继续培养。感染后9 6 h 裂解细胞，提取总R N A 与总蛋白。利用实时定量P C R检测H
10、 s a - m i R - 1 9 6 b 的表达变化，w e s t e mb l o t 检测P 2 1 0 蛋白表达变化，根据其结果评价H s a - m i R - 1 9 6 b 过表达对P 2 1 0 蛋白表达的影响。实验结果说明H s a - m i R 1 9 6 b 能抑制B C R - A B L 基因的表达，但不能说明这种抑制作用是由于直接的靶向调控所导致的，还是由于H s a - m i R - 1 9 6 b 靶向抑制调节了其它基因而影响到B C R - A B L 基因的表达。因此，还需要更多、更深入的实验来验证和研究H s a - m i R 1 9 6 b 对
11、B C R - A B L 基因的调节作用。本课题运用生物信息学分析筛选出潜在的能对C M L 致病基因B C R - A B L 进行靶向调控的m i R N A 分子。运用P C R 成功克隆其基因片段，构建得到p L L 3 7 m i R - 1 9 6 b 重组表达载体。通过病毒包装获得能高效感染哺乳动物细胞，持续、稳定表达H s a - m i R - 1 9 6 b 的慢病毒表达载体。应用该慢病毒载体感染I I I中文摘要B C R - A B L 基因阳性的K 5 6 2 细胞，并对感染结果进行检测，初步验证H s a - m i R - 1 9 6 b 对B C R - A
12、B L 基因表达具有抑制调节作用。这些都为将来进一1 9 6 b 的功能及H s a - m i R - 1 9 6 b 对B C R - A B L 基因的调控作用奠定R 1 9 6 bB C R - A B L 基因慢性髓性白血病慢病毒表达载体I V硕士学位论文P r e l i m i n a r yS t u d yo nt h eF u n c t i o no fH s a m i R - 19 6 bi nK 5 6 2c e l l sN a m e ：X i a n gX i n g y uS u p e r v i s o r ：P r o f M aW e n l iA
13、B S T R A C TL e u k e m i ai Sac a n c e ro fb l o o do rb o n em a r r o wc h a r a c t e r i z e db ya na b n o r m a li n c r e a s eo fb l o o dc e l l s ，u s u a l l yl e u k o c y t e s ( w h i t eb l o o dc e l l s ) I nC h i n a , l e u k e m i ai sac o m m o nm a l i g n a n tt u m o r , w
14、 h o s em o r t a l i t yi sa b o u t2 5 2 10m i l l i o n A c c o r d i n gt op r o l i f e r a t i n gc e l lt y p e s ，l e u k e m i aC a nb es u b d i v i d e di n t om y e l o i dl e u k e m i a , l y m p h o c y t i cl e u k e m i aa n dm o n o c y t i cl e u k e m i a A d d i t i o n a l l y
15、, l e u k e m i ai sc l i n i c a l l ya n dp a t h o l o g i c a l l ys u b d i v i d e di n t oa c u t el e u k e m i aa n dc h r o n i cl e u k e m i a C h r o n i cm y e l o i dl e u k e m i a ! a l s oc a l l e dc h r o n i cm y e l o g e n o u sl e u k e m i a ( C M L ) i sac l o n a lb o n em
16、 a r r o ws t e mc e l ld i s o r d e ri nw h i c hp r o l i f e r a t i o no fm a t u r eg r a n u l o c y t e sa n dt h e i rp r e c u r s o r si st h em a i nf e a t u r e s I ti sc h a r a c t e r i z e db yt h ei n c r e a s e da n du n r e g u l a t e dg r o w t ho fp r e d o m i n a n t l ym y e l o i dc e l l si nt h eb o n em a r r o wa n dt h ea c c u m u l a t i o no ft h e s ec e l l si nt h eb l o o d C M Li so f t e nd i v i
