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1、PriCells:PriCells: 收集大鼠骨髓用于生产收集大鼠骨髓用于生产 MSCsMSCs试剂和材料: 1. 完全培养基(CCM) :-MEM:-低限量基础培养基,含谷氨酰胺,无 核苷酸或脱氧核苷酸;添加:20%附加 L-谷氨酰胺 2mmol/L、经 FBS 杂 交瘤纯化,非热灭活、青霉素 100U/ml、链霉素 100g/ml。过滤除菌。 储存于 4,不超过 2 周; 2. 纱布; 3. 含 100U/ml 青霉素, 100g/ml 链霉素和 0.2g/ml 两性霉素 B 的 PBSA; 4. 无镁和钙的 Hanks 平衡盐溶液(HBSS) ; 5. 塑料 Petri 培养皿,15cm
2、 直径; 6. 装有#10 和#15 刀片的解剖刀; 7. 1 和 2 英尺刀刃的手术剪; 8. 镊子; 9. 止血钳; 10. 15cm 刀刃的咬骨钳; 11. 带 Luer 接头的注射器,20ml; 12. 皮下注射针,23 号和 18 号; 13. 微量离心管,1.5ml 和 0.5ml; 14. 聚丙烯离心管,15ml 和 50ml; 15. 成年 Lewis 大鼠; 16. CO2啮齿动物安乐死小室; 17. Eppendorf 5417C 微量离心器或同等设备;实验方法: 1. CO2窒息处死动物,切勿使用药物; 2. 用酒精擦拭后肢,在不破坏股骨的情况下解剖后肢。将股骨从肢体中分
3、离 出来; 3. 切除股骨上的肌肉和肌腱。用无菌纱布擦拭除去骨上的剩余组织; 4. 用酒精擦拭已清理干净的骨,将其放入 50ml 塑料管中; 5. 用含抗真菌药物的冰浴 CCM 浸没骨,直到骨髓提取准备完毕。从分离骨 到骨髓提取的时间尽量缩短; 6. 装有股骨的离心管移至微生物安全橱中,将骨放入 15cm petri 培养皿中; 7. 按如下步骤提取骨髓; (1) 用咬骨钳剪掉骨的两端,暴露内部骨髓; (2) 装有 23G 针头的注射器中吸入 5ml 含抗真菌药物的 CCM,向 50ml 离心管中冲洗每根股骨; (3) 吸取冲洗后的 CCM, 反复冲洗股骨 3 次, 将其转移至 15ml 离心
4、管中; (4) 1000g 离心,用 1ml 含抗真菌药物的 CCM 重悬骨髓沉淀; (5) 在15ml离心管中将1ml骨髓细胞悬液加入到4ml含抗生素和抗真菌 药物的新鲜 PBSA 中。 每根股骨所得的 5ml 细胞悬液可混合于同一个离心管中; 8. 在 10 1000g 离心骨髓细胞 10min,用 10ml 含抗生素和抗真菌药物的 PBSA 洗涤细胞 3 次; 9. 最后,用 5ml CMM 重悬骨髓细胞,置于冰上备用;PriCells 提供: 1. 各种原代细胞特制基础培养基; 2. 各种原代细胞培养特制添加剂; 3. 原代细胞分离试剂盒; 4. 原代细胞鉴定试剂盒; 5. 原代细胞总蛋白质抽提物; 6. 原代细胞总 RNA; 7. 原代细胞总 DNA;