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1、第二章 色谱分析法高效液相色谱分析3.1 高效液相色谱法的特点n高压：150350105Pan高速n高效：气相色谱n约为 2000塔板/米液相色谱n约为 30000塔板/米n高灵敏度：紫外检测 器：10-9g荧光检测 器：10-11g高效液相色谱法对比气相色谱 法的优点n对于高沸点、热稳定性差，相对分子质 量大（400）的有机物（占有机物总数 的7580%）原则上都可分离n流动相选择余地广n样品的回收比较容易高效液相色谱法对比气相色谱 法的缺点n缺少通用型检测器n“柱外效应”对柱效率及色谱分离影响较大n流动相价格较高n流动相有毒3.2 影响色谱峰扩展及色谱分 离的因素n色谱分离的基本理论 （P
2、10）塔板理论速率理论n涡流扩散项He He = 2dp n纵向扩散项Hd 影响峰扩散的主要物理性质 参 数气 体液 体扩散系数Dm/cm2s-110-110-5 密度/gcm-310-31 粘度/g(cms) -110-410-2n传质阻力项固定相传质阻力项流动相传质阻力项 n对液液分配色谱法，可使用薄的固定 相层；而对吸附、排阻和离子交换色 谱法，则可使用小的颗粒填料来解决 。n使用具有扩散系数大的液相固定液， 可改善传质。n减小流动相流速，亦可改善传质。不 过这些都是与分子扩散作用相矛盾的 ，而后者还会增长分析时间。 n流动相传质阻力项 流动的流动相中的传质阻力项Hm滞留的流动相中的传质
3、阻力项Hsm 悬浮聚合产生苯乙烯基二乙基苯聚合物的单体颗粒n流动的流动相中的传质 阻力项Hm 式中Cm是一常数，是容 量因子k的函数，其值 取决于柱直径、形状和 填充的填料结构。当柱 填料规则排布并紧密填 充时，Cm降低。 n滞留的流动相中的传质 阻力项Hsm 式中Csm是一常数，它 与颗粒微孔中被流动相所 占据部分的分数以及容量 因子有关。 nGiddings方程H近似正比于dp2，减小粒度是提高柱效 的最有效途径。 H-u曲线图液相色谱的H-u曲线 LC和GC的H图 固定相粒度大小对板高的影响 柱外效应n柱前峰展宽主要由进样所引起。液相色 谱法的进样方式，由于进样器的死体积 ，以及进样时液
4、流扰动引起的扩散造成 了色谱峰的不对称和展宽。若将试样直 接注入到色谱柱顶端填料上的中心点， 或注入到填料中心之内12mm处，则可 减少试样在柱前的扩散，峰的不对称性 得到改善，柱效显著提高。 n柱后展宽主要由接管、检测器流通池体 积所引起。由于分子在液体中有较低的 扩散系数，因此在液相色谱中，这个因 素要比气相色谱法中更为显著。为此， 连接管的体积、检测器的死体积应尽可 能地小。3.3 高效液相色谱法的主要类 型及其分离原理n液-液分配色谱法（liquid-liquid partion chromatography）及化学键合相色谱（ chemially bonded phase chrom
5、atography） n正相液-液色谱法（normal phase liquid chromatography）：一般为了避免固定液 的流失，对于亲水性固定液常采用疏水性流 动相，即流动相的极性小于固定液的极性。n反相液-液色谱法（revers phase liquid chromatography）：流动相的极性大于固 定液的极性 ，出峰顺序正好与正相液-液色 谱相反。 液-固色谱法 或称液-固吸附色 谱法（liquid-sold adsorption chromatography） 其作用机制是溶质分子（ X ）和溶 剂分子（ S ）对吸附剂活性表面的竞争 吸附，可用下式表示： 这种竞争吸
6、附达到平衡时，可用下式表示:离子交换色谱法（ion- exchange chromatography） 离子对色谱法（ion pair chromatography） 离子色谱法（ ion chromatography, IC) n在阴离子分析中，试样通过阴离子交换树脂 时，流动相中待测阴离子（以Br-为例）与树 脂上的 OH-离子交换。洗脱反应则为交换反应 的逆过程:n直接洗脱： Br-和OH-n使分离柱流出的洗脱液通过填充有高容量H+型阳 离子交换树脂的抑制柱，则在抑制柱上将发生两 个非常重要的交换反应：空间排阻色谱法（steric exclusion chrormatography)3.
7、4.1 液-液色谱法及离子对色 谱法固定相n全多孔型担体（porous micro beads support）：氧化硅、氧化铝、硅藻土制成 的直径为100m左右的全多孔型担体。目 前粒度为510m的全多孔微粒担体是使 用最广泛的高效填料。 n表层多孔型担体，又称薄壳微珠担体（ pellicuar micro bsads support）：直径为 30-40m的实心核（玻璃微珠），表层上 附有一层厚度约为12m的多孔表面（多 孔硅胶） 。 n硅氧碳键型（Si-O-C）n硅氧硅碳键型（Si-O-Si-C) n硅碳键型（Si-C）n硅氮键型（Si-N） 化学键合固定相化学键合固定相的特点 n表面没
8、有液坑，比一般液体固定相传质 快得多；n无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性 和寿命；n可以键合不同官能团，能灵活地改变选 择性，应用于多种色谱类型及样品的分 析。n有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的 检测器和馏分的收集。 3.4.2 液-固吸附色谱法固定相 硅胶、氧化铝、分子筛、聚酞胺等 。 仍可分为全多孔型和薄壳型两种， 其特点如前述。目前较常使用的是5 10m的硅胶微粒（全多孔型）。 3.5 液相色谱法流动相 在选择流动相时应注意下列几个因素：n流动相纯度：一般为分析纯试剂，必要时 需进一步纯化，以除去有干扰的杂质。n应避免使用会引起柱效损失或保留特性变 化的溶剂 n对试样要有适宜的溶解度
9、：否则会在柱头 易产生部分沉淀。 n溶剂的粘度小些为好 n应与检测器相匹配 在选用溶剂时，溶剂的极性为 重要的依据 离子交换色谱n增加盐（离子强度）的浓度导致保留值 降低 n对阳离子交换柱，流动相 pH 增加，使 保留值降低；在阴离子交换柱中，情况 相反。 3.6 高效液相色谱仪 五个部分：高压输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统、记录仪。3.6.1 贮液器及流动相n贮液器：耐腐蚀，能密封。常用不锈钢、聚四氟乙烯、玻璃等。n流动相（溶剂）：过0.45m微孔滤膜，脱气（加热、抽真空、吹氮、超声波）3.6.2 高压泵 按性质可分为恒流泵和恒压泵两类 ：n往复式柱塞泵 特点：连续供给恒定 体积的流动
10、相。不足之处是输出有脉冲波 动。n100次/minn气动放大泵（pneumatio pressure intensifier） 特点：不适用于频繁更换流动相的 选择合适溶剂的试验，也不便于梯度洗 提（需要用两台泵）。但它能供给无脉 冲的、稳定流量的输出。 3.6.3 洗脱方式 n等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个 泵）n梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种 类和比例，即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）3.6.4 进样装置 n注射器进样装置 （隔膜进样）优点：可以任意改变进样体积，注射快 速，不易造成峰扩
11、张缺点：无法测定保留时间，重现性较差 ，试液容易渗漏n高压定量进样阀 ：不必停泵，六通阀优点：进样量的可变范围大，耐高压，易 于自动化缺点：容易造成色谱峰扩张六通进样阀3.6.6 检测器 n示差折光检测器（differential refractive index detector ） ：利用折光率的差别进 行检测，是通用型检测器缺点：灵敏度低，温度要求严格紫外光度检测器（ultraviolet photometric detector） ：常用型检测器，检测限可达10-9gmL-1优点：这种检测器对温度和流速不敏感， 适宜于梯度洗提缺点：不能用于对紫外-可见光完全不吸 收的试样的检测光电二极管阵列 检测器（photo- diode array detector）是紫外可 见光度检测器的一个 重要进展。n荧光检测器（fluorescence detector）优点：一般情况下，荧光检测器比紫外 光度检测器的灵敏度要高2个数量级缺点：其线性范围约为103只能分析自身发光的物质 n电导检测器：是离子色谱法中使用最广 泛的检测器。 原理：根据物质在某些介质中电离后所 产生电导变化来测定电离物质含量。缺点：受温度的影响较大，严格控制温 度。3.7 高效液相色谱分离类型的 选择 n作业：nP109 第4、5、6、7题。
