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1、液相色谱原理与应用丁 明玉清华大学 化学系 分析化学研究所 理科楼D319，Tel: 研究方向：色谱分析；中药化学色谱法分类（按流动相种类）色谱类型 流动相 主要分析对象气相色谱 气体 挥发性有机物液相色谱（LC） 液体 可溶性物质超临界流体色谱 超临界流体 各种有机化合物电色谱 缓冲液、电场 离子，各种有机物l高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC ）l高压液相色谱（ high pressure LC, HPLC）l高速液相色谱（ high speed LC, HSLC）l高分辨液相色谱（ high resolution LC,
2、HRLC）讲课主要内容1.HPLC概述2.HPLC仪器与功能部件3.HPLC常用分离模式4.离子色谱（IC）5.HPLC新技术6.HPLC样品前处理样品：植物的石油醚提取液 碳酸钙：固定相 石油醚：流动相石油醚 (流动相）1.HPLC概述l 1903年，俄国植物学家 Tsweet为了分离植物色素发明了色谱技术。（吸附 色谱）Chromatography（层析法、色层法）Michael Tswett (1872-1919)色谱法的发展色谱法的发展历史历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn, Lederer用氧化铝
3、和碳酸钙分离-、-和-胡萝卜素。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath, Flodin
4、发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970
5、生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究HPLC按用途分类分析型LC（实验室用）制备型LC（高压、小规模）（常用低压和中压制备LC）制备色谱是分析型色谱的放大；(原则上)所有分离模式都可用于制备色谱。按仪器构成或关键部件大小分类l常规HPLCl微柱、半微柱HPLCl微纳HPLC（毛细管HPLC）l便携式HPLCl微型HPLC、芯片HPLCl超高压液相色谱（UPLC）l多维（二维）液相色谱HPLC按分离机理分类 吸附色谱 分配色谱（正相和反相） 凝胶色谱（渗透和过滤、高
6、温和低温） 离子色谱（交换、排斥、离子对） 亲和色谱 手性色谱 亲水作用色谱 疏水作用色谱 分子印迹HPLC样品带的移动方式洗脱法 前沿法 置换法洗脱法：l最方便的色谱操作方式； 分析型色谱普遍采用此法。l一次性上样，流动相连续 通过固定相，样品中的组分 依次被洗脱流出色谱柱。l流动相和固定相通常处于平衡状态。组分因在两相中的平 衡分配系数（与固定相的作用力）不同，在固定相中停留的 时间不同，最终按与固定相作用力从小到大的顺序依次分 开。强保留组分 中等保留组分 弱保留组分洗脱法色谱分离过程洗脱法色谱分离过程平衡过过程流动动相色谱图前沿法：洗脱法 前沿法 置换法l 混合物中各组分的量化困难；实
7、验结束时，色谱柱将被样 品污染，所以，前沿法很少用于制备分离。l 通常用于测定单一组分或简单混合物的吸附等温线，以及 从主成分中分离作用较弱的微量成分。l 是固相萃取的基础，适合复杂样品中微量成分的富集。l 样品溶液作流动相连续流经 色谱柱。与固定相作用力弱的 组分先以纯物质的状态流出色 谱柱，其次流出的是亲和力较 强的第二组分和第一组分的混 合物，依此类推。洗脱法 前沿法 置换法置换法：l一次性上样，用置换剂作流 动相连续流经色谱柱，组分依 次置换下来。l置换剂与固定相间的作用力 比样品中任何组分都强。各组 分按与固定相作用力从弱到强 的顺序依次流出色谱柱。l 如果色谱柱足够长，则可达到稳定
8、状态，色谱柱中形成连 续的纯组分的矩形区带；l 主要用于制备色谱和工业流程色谱。l 根据实验条件，各组分区带间的边界不一定是连续的，纯 物质的收集可以控制在各置换区带的中心区域。2.HPLC仪器与功能部件l厂家多、仪器种 类多、国产仪器 发展快。高压泵 进样器 色谱柱 检测器 工作站HPLC仪器结构高压输液泵对泵的基本要求： 高稳定性。直接关系到分析结果的重复性和准确性。 流量控制准确。精度通常要求小于0.5%。 一般要求能够耐40MPa（400kg/cm2）以上的高压。 泵的死体积要小。通常要求小于0.5mL。 能精确地调节流动相流量。流量测定精度约0.1%。 最大流量：通常5、10mL/m
9、in。 在线脱气装置（惰性气体鼓泡吹扫、真空脱气 ）高压泵几种高压输液泵的性能比较名 称 恒流或恒压 脉冲 更换流动相 梯度洗脱 价格气动放大泵 恒压 无 不方便 两台泵 高螺旋传动注射泵 恒流 无 不方便 两台泵 中等单柱塞往复泵 恒流 有 方便 可 较低双柱塞往复泵 恒流 小 方便 可 高隔膜往复泵 恒流 有 方便 可 中等高端HPLC均采用双柱塞往复泵。由于分析物组成复杂，以某一恒定组成的流动相可能 使部分待测物得到好的分离，但同时又使其它待测物的 分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯 度洗脱（LC）来解决这个问题。梯度洗脱技术：HPLC梯度方式目的：在合理时间内使保留差异
10、很大的组分都充分分 离。原理：逐渐增加流动相洗脱强度。实现方法：高压梯度与低压梯度；线性梯度与阶梯梯 度。高压梯度（外梯度）由两台高压泵构成 不产生气泡 价格稍高高压梯度混合器低压梯度（内梯度）比例阀l 只需一台高压泵；l 混合时易产生气泡，需配在线真空脱气装置；l 适合多元流动相。l 四元梯度泵最常用脱气（在线真 空脱气装置）在线真空脱气装置原理抽真空流动相至色谱泵只有小分子气体能通过的多孔膜管路密闭容器装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱进样器手动（六通阀）进样器自动进样器故障点：漏液（磨合密封性）注意：进样口污染、进样量应大于定量环HPLC柱： 常规尺寸填充柱仍然是主流；微柱HPLC在
11、液质联用中有 用武之地；整体柱常用于生物样品快速分离。 不锈钢柱管内壁需抛光。 一般采用高压（如60MPa）匀浆法填充。 超细颗粒（如1m粒径）填充柱需要超高压HPLC仪器。 310m颗粒填充柱柱效在28万塔板/m。 离子色谱柱为塑料柱管（塑料管线）。HPLC填料的结构 构成：载体（基质）+ 功能层。 载体：无机载体（硅胶、氧化铝、氧化锆等）和有机 聚合物载体（葡聚糖、交联聚苯乙烯等）。载体应具有一定刚性（承受一定压力），它对分离不 起明显作用，但其的物理性质会影响分离效果。 功能层：功能层的性质决定色谱分离模式（机理）功能层中分子种类和所带功能基团决定功能层性质。载体微球的制备 载体的性质对
12、分离也有明显影响。 载体微球的球形越好、粒径分布越窄、粒径越小，分 离效率越高。 载体通常为多孔性的，孔道中也可修饰上功能层。孔 的形状、大小影响传质过程。 实心载体微球很少用，其对传质过程几乎没有影响。 微球的商业化制备技术很高，国际上由几大公司垄 断。 硅胶微球是色谱填料的主流。载体表面修饰 只有经过特殊修饰的固定相才有高效的分离性能。 修饰分为键合（功能分子与载体表面活性基团反应形成共 价结合）与包覆（功能分子与载体表面靠分子间相互作用 结合）。 键合（固定）相性能稳定，是HPLC固定相的主流。 封尾技术：硅胶载体键合上功能分子后，残余硅醇基用硅 烷化试剂（如三甲基氯硅烷）反应除掉，以消
13、除次级相互 作用带来的不利影响。（碱性化合物峰拖尾现象）整体柱：色谱固定相新技术 又称连续床(continuous bed)或连续棒； 整体柱在色谱柱内原位聚合制成； 被誉为第四代色谱填料； 优点：不需用细粒径的填料去填装；制备简单；渗透 性好；传质速度快；不需烧塞子；易于改性。 近年发展很快，已用于蛋白质、氨基酸、低聚核苷 酸、类固醇、芳烃、聚合物等物质的分析。 主要用于HPLC、毛细管电色谱和样品前处理。 整体柱尺寸：常规、微柱、毛细管柱、制备柱。整体柱的发展简史 1967年，Kubin 等以聚2-甲基羟乙基丙烯酸酯凝胶为整体 柱,以低压柱色谱的方式分离了蛋白质,缺点高度溶胀 1989年,
14、Hjertn等在空柱管中加入单体、引发剂及致孔剂 的混合溶液原位聚合后制得聚丙烯酰胺凝胶，再将其高压 压入一空色谱柱制得软基质整体柱，成功地用于蛋白质及 多肽的分离，是整体柱发展的一个里程碑 。 1992年，Svec等制备甲基丙烯酸酯刚性聚合物整体柱，由 于具有优异的通透性、高空间利用率、制备简单等优点， 得到充分重视和广泛应用 。 1996年，Tanaka等制备硅胶整体柱,与德国Merck公司联合 推出商品整体柱。聚合物整体柱与硅胶整体柱l聚合物整体柱（如聚丙烯酰胺类、聚甲基丙烯酸酯类、 聚苯乙烯类）：具有较好的重复性、适用pH值范围宽、选 材范围广和易于制备的优点。但存在溶胀、受热变形，机
15、 械性能差的不足。l硅胶整体柱：在孔径控制、机械性能、耐溶剂等方面显 示出一定的优越性。但存在适用pH范围窄，制备过程复杂 ，硅胶整体柱的制备和化学修饰不能同时进行,需分步完 成，对蛋白质有吸附作用等局限性。 u整体柱可以制成不同尺寸，但以毛细管柱最易制作。聚合物基质整体毛细管色谱柱的制备第一步: 弹性石英毛细管的预处理 l引入双官能团试剂-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（-MAPS）， -MAPS一端含烷氧基团，与毛细管的硅羟基反应；另一端含双键，在单体聚合时参与聚合反应。 聚合物组成：l 单体：甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)l 交联剂：乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)l 致孔剂：正丙醇，丁二醇，水l 引发剂：偶氮二异丁腈(AIBN)第二步：第二步：聚合物整体柱骨架形成聚合物整体柱骨架形成第三步：第三步：固定相表面改性例如：Na2SO3 改性，引入磺酸基修饰上各种功能分子，获得不同类型固定相。强阳离
