《乳腺癌患者髓系来源抑制细胞的临床观察及相关免疫耐受机制探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乳腺癌患者髓系来源抑制细胞的临床观察及相关免疫耐受机制探讨（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号：密级：学位类别：R 7 3 7 9科学学位囹专业学位口学校代码：10 062学号：2 0 1 0 6 0 2 4 8 9学科门类：医学 又肄眚科鼻等硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I O N论文题目：乳腺癌患者髓系来源抑制细胞的临床观察及相关免疫耐受机制探讨TIT L EC l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo fm y e l o i d d e r i v e ds u p p r e s s o rc e l l si nb r e a s tc a n c e rp a t i e n t sa n
2、 ds t u d yo ni m m u n o s p r e s s i o nm e c h a n i s m s一级学科：临床医学二级学科：肿瘤学论文作者：杨宝宏指导教师：任秀宝教授导师组成员：于津浦副研究员天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：学位论文版权使用授权书日期：艄月吒本学位论文作者
3、完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密田。( 请在相对应的方框内打“”)学位论文作者签名：导师签名：桶张日期：pf j r 年乡月矽f 7 t 越兰日期：“ l , 1 4 年J 、月l - 9F t天津医科大学硕士学位论文中又捅斐目的：检测乳腺癌患者肿瘤原位组织分离的一群髓系来源抑制细胞( M D S C ) 中吲哚胺2 ，3 双加氧酶( i n d o l
4、e a m i n e 2 ，3 - d i o x y g e n a s e ，I D O ) 的表达情况，探讨I D O 对M D S C 介导T 淋巴细胞免疫抑制作用的影响。方法：收集3 0 例乳腺癌患者的肿瘤组织和外周血，3 0 例健康供者外周血，将肿瘤组织制成单细胞悬液，采用免疫磁珠技术分选肿瘤单细胞悬液中C D 3 3 + M D S C和健康供者外周血中的C D 3 3 + 细胞，应用W e s t e mb l o t 和P C R 方法检测M D S C中I D O 的表达情况。将肿瘤组织来源M D S C 和异体T 淋巴细胞按照1 ：l 比例混合培养3 天，在加用和不加I
5、 D O 特异性抑制剂1 - M T 条件下，利用A n n e x i n V凋亡试剂盒检测各组T 淋巴细胞凋亡率，利用E L I S A 法检测各组T 淋巴细胞分泌的细胞因子量。结果：在正常人外周血、乳腺癌患者外周血、乳腺癌患者肿瘤单细胞悬液中M D S C所占比例分别为( 4 9 土4 3 8 ) 、( 1 2 9 2 士6 2 4 ) 、( 1 7 1 8 1 5 1 9 ) 。与正常人外周血相比，乳腺癌患者外周血和肿瘤单细胞悬液中M D S C 比例显著升高( P0 0 5 ) 。3 次重复实验结果提示M D S C 显著抑制异体淋巴细胞分泌I F N Y ，促进T G F B 、I
6、 L 1 0 释放( 图7 ) 。$ O Od S Oa O O耋S Oo o一2 S 02 0 0：1 5 0I o oS OOl 簟| F N yG 卜参d屯- ：O_嗣T 0 I lM O S C T O 0 5 ) 。结果提示M D S C 显著抑制异体淋巴细胞分泌I F N y ，促进T G F 1 3 、I L 1 0 释放( 图6 ) 。T G F B 在M D S C 所介导的免疫抑制中发挥重要作用，具有C D l l b + G r 1 i n t表型的M D S C 在I L 1 3 的刺激下可释放T G F D 。实验表明，肿瘤细胞在缺乏I I型T G F p 受体的情况
7、下，肿瘤微环境中有蓄积的T G F p ，同时伴有蓄积的C X C L 5 。C X C L 5 可以招募表达C X C L 2 的C D l l b + G r + M D S C ，与正常小鼠相比，来自有肿瘤负荷小鼠的C D ll b + G r + 细胞可释放大量的T G F B ，因此肿瘤浸润性M D S C 最有可能导致了肿瘤微环境中T G F 。B 的大量增加，造成免疫抑制【3 2 】。I L 1 0 ，在M D S C 所介导的免疫抑制中亦发挥重要作用。在I L 1B 所诱导的炎症反应中，M D S C 大量蓄积并释放I L 1 0 ，能够显著降低巨噬细胞释放I L 1 2 从而
8、影响其免疫功能I l 引。除此之外，M D S C 可以通过释放可溶性介质下调T 细胞表面T C R 相关的6 链来发挥免疫抑制，在缺乏6 链的状态下，T 细胞不能传递活化所需要的信号分子，从而引起细胞不能活化【3 引。近来发现M D S C 还町以下调T 细胞表面C D 6 2 L 的表达从而影响原始T 细胞向淋巴结的迁移，结果导致活化的C D 4 + 和C D 8 + 细胞减少【l 川。3 5 目前M D S C 的产生及免疫抑制作用机制分析关于M D S C 的免疫抑制机制的研究，国外的实验大多是以小鼠为对象的。有研究发现在小鼠腹腔内注射a n t i G r l + 抗体( R B 6
9、 8 C 5 ) 清除M D S C ，肿瘤内浸润的T r e g 就会显著降低，结果提示M D S C 参与诱导了肿瘤内T r e g 的形成。还发现E P 2 E P 4 在M D S C 中高表达，提示P G E 2 可能主动通过协同方式促进M D S C的趋化迁移，促进肺癌的转移复发。又有报道，M D S CA R G I 酶的活性依赖于2 0天津医科大学硕士学位论文讨论肿瘤细胞分泌的P G E 2 1 6 J ，C O X 2 抑制剂可以抑制M D S CA R G I 酶表达，重新激发抗肿瘤的T 细胞反应。此外，P G E 2 还可以上调T r e g 细胞表达F o x p 3
10、“ I p D C表达I D O l l 引。P G E 2 很可能通过上调肿瘤的T r e g 细胞表达F o x p 3 以及p D C 表达I D O 进一步增强肿瘤的侵袭迁移能力发挥促肿瘤侵袭、迁移【2 l 】。鉴于M D S C 在肿瘤免疫中的抑制作用，当前许多研究集中在寻找有效治疗方法去除这些细胞。有人试图使用G r - 1 抗体去除G r - 1 州C D l l b + 的M D S C ，但考虑到G r - 1 不仅在M D S C 上表达，在成熟的粒细胞上也有表达，两者如果同时去除，有导致严重感染的可能。最值得关注的是在不同的体外实验中已经印证这群细胞有免疫抑制功能，而且将
11、荷瘤鼠体内的这群细胞去除可以改善免疫系统的机能状态，例如反维甲酸能在体内促进荷瘤鼠M D S C 分化为成熟D C 、巨噬细胞、粒细胞从而增强T 细胞介导的抗肿瘤免疫，并能增强肿瘤疫苗的效果f 2 2 1 。S u z u k i 等用G e m c i t a b i n e 选择性的降低荷瘤鼠的脾脏M D S C ，增强了抗肿瘤免疫，其次抑制与M D S C 抑制功能密切相关的精氨酸代谢酶如A r g l 、i N O S ，也可以减少M D S C含量1 2 川。有文献报道M D S C 能产生大量的N O 和活性氧( R e a c t i v eo x y g e ns p e c
12、i e s ，R O S ) ，M D S C 可通过产生N O 和R O S 抑制机体抗肿瘤免疫1 2 2 2 。3 6M D S C 通过影响局部代谢环境介导免疫抑制肿瘤诱导产生的M D S C 通过多种途径介导肿瘤免疫逃逸，越来越多的研究显示，氨基酸消耗如精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸在M D S C 所介导的肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。我们在将分选的M D S C 分别进行了W e s t e r nb l o t 和P C R 检测，发现这群细胞有I D O 的高表达，在对照组细胞中未检测到I D O 的表达。如图4 、图5 所示。我们推测M D S C 的免疫作用O L N 中
13、有可能I D O 参与免疫抑制调节。I D O ( 吲哚胺2 ，3 双加氧酶) 是肝外色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢过程中的限速酶。通过降解局部色氨酸，积累具有细胞毒性和促凋亡作用的代谢物，从而抑制自身反应性T 淋巴细胞的增殖。结合最近关于I D O 的研究结果，发现I D O 通过直接抑制T 细胞的活性和增强局部T r e g s 介导的免疫抑制，I D O 能够在肿瘤和肿瘤回流淋巴结中建立一个强大的耐受性微环境。这与目前分析的M D S C 的免疫抑制作用机制相一致。本实验中我们还检测了T 淋巴细胞在正常情况下与和M D S C 共培养以及应用I D O 特异性阻断剂下三组的凋亡情况，结果显
14、示：T 细胞单独培养凋亡率为( 2 4 0 a ：0 6 6 ) ，M D S C 组T 细胞凋亡率为( 1 2 3 0 - 士0 8 0 ) ，1 M T 组T 细胞2 1天津医科大学硕士学位论文讨论凋亡率为( 3 3 0 - a ：0 5 8 ) 。M D S C 组T 细胞凋亡率较对照组明显升高，差别具有统计学意义( 尸 0 0 5 ) 而加用I D O 特异性抑制剂1 - M T 组与M D S C 组相比，凋亡率明显降低( P 0 0 5 ) ，在加用I D O 特异性抑制剂1 - M T 组与T 细胞单独培养时相比，差别并没有统计学意义，提示I D O 在诱导T 细胞凋亡的过程中起
15、重要作用。色氨酸在T 细胞增殖分化中发挥重要作用，而I D O ( 吲哚胺2 ，3 双加氧酶)是肝外色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢过程中的限速酶。在肿瘤中发现I D O 可降解局部色氨酸，积累具有细胞毒性和促凋亡作用的代谢物，从而抑制效应性T淋巴细胞的功能【2 。在黑色素瘤，乳腺癌，肺癌和结肠癌的小鼠和人群的引流淋巴结中均发现表达I D O 的细胞，表达I D O 的细胞包括巨噬细胞亚群，树突状细胞亚群等，这群细胞均为髓系来源但是缺乏明显表型特征【5 4 1 。越来越多的研究表明I D O 参与了针对肿瘤的免疫抑制，其机制具体表现在： I D O 可以在肿瘤周围和引流淋巴结中阻断针对肿瘤相关抗原
16、的初始应答；阻断激活的T 细胞对肿瘤细胞的杀伤；增强调节性T 细胞( T r e g ) 的免疫抑制功能【2 3J 。氨基酸代谢在M D S C 发挥免疫抑制的作用中越来越受到关注，多项研究已证实L 一精氨酸减少引起的T 细胞功能障碍，在M D S C 介导的免疫耐受中联系密切，A R G l 和N O S 2 ，是两种主要的与M D S C 发挥免疫抑制作用的代谢酶，它们拥有共同的作用底物L 精氨酸，对应的代谢产物分别是尿素和L 鸟氨酸、N O和瓜氨酸I j6 | 。通过消耗L 精氨酸而造成“精氨酸饥饿”的内环境，抑制A P C 、T细胞的增殖活性1 3 。在小鼠的巨噬细胞中，T H 2 细胞因子，T G F B ，G M C S F 等促进A R G l 的表达，其表达与S T A T 6 通路相关p 引。而在小鼠的巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，D C 细胞，N K 细胞中，N O 的产生则与N O S
