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1、抗病毒生防菌抗病毒生防菌 F-01 菌株发酵条件优化菌株发酵条件优化摘摘 要要 ：以高氏 1 号培养基为基础, 通过单因素分析和正交试验, 对抗病毒生防菌 F-01 菌株最佳培养基和最优培养、条件进行了研究。结果表明:适宜 FX05 产抑绿脓杆菌活性物 质的发酵培养基配方为小米粉（2g）、酪蛋白胨（0.1g）、K2HPO4 (0.05g)、MgSO4.7H2O (0.05g)、NaCl (0.05g)、FeSO4.7H2O(0.001g)。发酵条件为初始 pH 为 8.0, 培养温度为 28 , 培养 120 h 产抑菌物质达最大值。关键词： 抗病毒生防菌;活性物质;培养条件优化第一章 绪论
2、1.1 链霉菌活性产物 链霉菌是放线菌目的一科。基内菌丝不断裂，气生菌丝通常发育良好，形 成长（有时短）的孢子丝。孢子不能运动，外鞘上常有疣、刺或毛发等状饰物。 链霉菌是抗生素产生最丰富最多的放线菌种属，长期以来一直被开发各种用途 的抗生素，随着天然产物化学和病理学研究的不断深入，人们从链霉菌中逐渐 发现的生物活性物质除了抗生素外，还有酶制剂、免疫调节物质、药理活性物 质、抗菌剂、植物生长调节剂、杀虫杀螨和除草剂等多种物质。链霉菌是天然 活性物质与药物的重要微生物资源，是研究微生物生长、发育和次生代谢功能 的良好材料。由于其复杂的形态、独特的代谢途径及次生代谢产物的多样性， 链霉菌已成为人们关
3、注和研究的重点对象，显示了链霉菌在科学、经济以及社 会领域巨大的研究价值。 放线菌中以链霉菌合成抗生素次生代谢产物的能力最强，链霉菌可产生多 种次生代谢产物，包括水解酶与抗生素等物质，其在医药、饲料添加剂等领域 有广泛的应用，而且在植物保护方面发挥了相当大的作用。链霉菌基因组是目 前己知的最大的原核生物基因组，其基因组染色体呈线状，而且具有复杂的结 构。基因组中 GC 含量平均为 73。天蓝色链霉菌假（Streptomy- ces.coelicolor）作为链霉菌属的典型代表种，其全基因组序列已于 2001 年 7 月在英国剑桥 Sanger 中心测序完成，这是第一个完成的全基因组测序的链霉菌
4、， 也是第一个完成全基因组测序的放线菌。链霉菌染色体富含次生代谢基因簇和 调控基因,链霉菌中某一特定次生代谢途径相关的基因通常以基因簇“7VK6MAI# 的形式存在线状染色体上,链霉菌基因组富含次生代谢物合成基因簇.链霉菌基 因组同样富含编码调控蛋白的基因,链霉菌这种基因组构成特点与其生存在高度 竞争的土壤环境中相适应。土壤中存在各种胁迫压力（化学、物理和生物的）， 而链霉菌是静止生物，面对胁迫相对被动。因此，链霉菌除产生抗生素抑杀 “异己”外，其基因组富含编码调控、转录蛋白的基因也有利于其感应各种环 境信号和生理信息并作出反应，行使各种复杂功能，从而在具有高度竞争的土 壤环境得以良好的生存。
5、放线菌产生的抗生素中有 90是以链霉菌作为生产菌 种生产的现已从链霉菌中得到土霉素、金霉素，氯霉素、红霉素等氨基糖苷类、大环内酯类，多烯类、聚醚类抗生素。由于抗生素的广泛及长期应用，细 菌对抗生素的耐药性问题日益严重，因此迫切要进一步发现和开发新型、高效、 低毒的抗耐药菌抗生素。随着抗生素数量的不断增加，从链霉菌中筛选到的新 抗生素就变得越来越困难，筛选得到的化学物质重复率非常高。然而这并不意 味着链霉菌中可发掘的资源没有了，根据天然产物趋势推测，链霉菌中还存在 大量未知的抗生素有待进一步挖掘。作为一种很有潜力的发掘新抗生素的途径， 共培养诱导方法为现有微生物资源的开发与利用揭示了新思路。链霉
6、菌是存在于土壤当中的一类重要的微生物类群，其可以产生丰富的次生 代谢产物，是重要的天然抗生素来源，一些链霉菌代谢产生的抗生素类的次生 代谢产物可以有效抑制水稻纹枯病的发生。拮抗放线菌生物防治病害的途径主 要有两种途径：一是寄生在植物组织体内，诱导植物自身产生抗病性或代谢出 一些具有抑菌作用的活性物质（抗生素）影响病原菌的新陈代谢过程，从而达 到防病治病的目的；二是在寄主体外利用。链霉菌是具有复杂生活周期的革兰氏阳性放线菌，系统生物学上归于链霉菌 属，该属的许多成员都能产生对人类具有重要意义的天然代谢物，如目前临床 上应用的抗生素约三分之二来源于链霉菌(该属产生的代谢物还包括抗肿瘤剂) 免疫抑制
7、剂，抗虫剂以及其他胞外水解酶!如淀粉酶，几丁质酶，纤维素酶，果 胶酶，木聚糖酶和蛋白酶等。链霉菌对植物病害的生防作用机制包括拮抗作用、 竞争作用和诱导植物抗性作用等方面，其生防效果往往不是单方面的，而是以 上几种方式作用的综合结果，不同生防机制之间往往存在着协同作用。由于链 霉菌防治植物病害时存在防治效果难以稳定、持久等缺点，寻找提高链霉菌防 治植物病害效果的途径显得十分重要。提高链霉菌防治植物病害效果的途径有 诱变育种、固定化技术和改良发酵工艺等，其目标是为了提高目标产物的产量 和纯度，减少副产物，改变生物合成途径，以获得高产的新产品。人们经常通 过种内融合或者紫外诱变等方式提高链霉菌分泌抗
8、生素的能力，以提高其抑菌 能力。1.2 病毒危害病毒（virus)由一个核酸分子（DNA 或 RNA）与蛋白质（Protein）构成或仅 由蛋白质构成（如朊病毒）。病毒个体微小，结构简单。病毒没有细胞结构， 由于没有实现新陈代谢所必需的基本系统，所以病毒自身不能复制。但是当它 接触到宿主细胞时，便脱去蛋白质外套，它的核酸（基因）侵入宿主细胞内， 借助后者的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒。约 75的传染病是 由病毒引起的，其中动物病毒是引起人类疾病的重要病原。病毒的结构、酶和 复制机制是抗病毒药物的作用靶点，所以抗病毒药物在攻击病毒的同时，往往 对宿主产生毒性反应。病毒是一类形态最小，
9、结构最简单的细胞内寄生微生物。 病毒利用宿主细胞的酶系统进行代谢活动，其复制周期与宿主细胞的代谢密切 相关。 植物病毒是一类侵染被子植物、裸子植物和蕨类植物的重要病原微生物。 植物病毒种类多、繁殖速率快、传播途径广，并且缺少有效的防治药剂和应对 措施，植物病毒病一旦发生流行，就会造成严重的损失。植物病毒病的危害， 已经远远超过真菌、细菌病害，而且近些年来由于全球一体化进程的发展，国 际商品贸易日趋发达，农产品流通迅速，加快了植物病毒病在世界范围内的传播。植物病毒在全世界范围内引起农作物、果树、花卉、牧草、药用植物的病 害，造成产量和品质的下降，严重影响到人类的生产生活。烟草花叶病毒 (Toba
10、cco mosaic virus，TMV)是人类最早进行科学研究的一类植物病毒，但因 为对其特性了解仍不够充分，只归类到属，没有科的分类。 植物病毒病有“植物癌症”之称，是农业生产上重要病害之一。由于植物 病毒属绝对内寄生生物，自身无能量代谢系统，对寄主植物细胞具有高度依赖 性，因而植物病毒病的防治一直是植物病害防治中的一大难题。为控制植物病 毒病造成的危害，人们对其防治进行了许多有益的尝试。烟草花叶病毒病是全 世界烟草栽培地区普遍发生的一类病害，也是我国各烟区的重要病害。烟草花 叶病流行年份田间发病率一般在 30-50，通常受 TMV 侵染的烟草植株体内代 谢会受到严重影响，叶片不均匀地褪绿
11、、枯黄，光合速率下降，这使得植株生 长矮小，干物质积累减少，一般年份减产 20-30，流行年份则毁种甚至绝收， 不仅造成烟草的产量损失，而且使烟叶的质量严重下降，特别是中上等烟叶比 例和内在质量下降使得烟草花叶病已成为烟叶优质生产栽培的重大障碍，造成 极大的经济损失，挫伤了烟农的生产积极性。由于植物病毒对寄主细胞具有绝 对寄生性，以及植物缺乏与动物类似的免疫代谢系统，使得植物一旦被感染就 处于终身受害的状态，这给农业生产带来相当大的破坏。因此，控制烟草花叶 病的危害已成为当前烟草生产中急需解决的问题。 病毒感染是许多传染病和菲传染病甚至癌症的病因，由于其特殊的生存方 式，人类在对付病毒性疾病的
12、过程中还没有找到有效的方法。天然产物是研究 开发薪药的重要资源，自 19831994 年间约 60被批准应用的抗癌和抗感 染药物来源于天然产物“。蓝藻是地球上最早出现的光合自养生物，在长期 的演化过程中形成了广泛的适应性。从蓝藻中分离具有不同生物活性的次级代 谢产物，并以此为先导化合物进行新药物开发，已引起药学工作者极大的关注。TMV 是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的代表种。该属病毒为正义单链 RNA(positiveSENSE single-strandedRNA，+ssRNA)病毒，病毒复制时正链基因 组 RNA 首先复制出负链 RNA(negmive senseRNA，RNA
13、)，再以负链 RNA 为模版 产生正链基因组及亚基因组 RNA。病毒粒子为刚直的长杆状，长 300hm，直径 18nm，螺旋对称结构，有 2130 个蛋白亚基以右手螺旋排列，螺距为 23nm， 负染色后在电镜下中央轴槽清晰可见。1.3 抗病毒活性成分植物病毒是危害农作物的一类重要病原，因其危害大、防治困难，俗有植物 癌症之称。由于植物病毒对植物细胞的绝对寄生性，病毒复制所需要的物质、 能量场所等完全由寄主提供，病毒能够胁迫寄主细胞的生化机理，使其与病毒 本身的生化机理纠缠在一起难以识别，所以药物难以只对病毒进行选择性攻击 而不伤害寄主细胞，导致研究高选择性的化学抗病毒制剂面临极大的困难，至 今
14、仍未取得重大突破。对烟草花叶病(Tobacco Mosaic Virus，简称 TMV)的防 治，国内外已做了大量的研究，特剃是在植物抗病毒基因研究上取得了一系列 进展，但是由于远缘杂交的不亲和性，使由抗性基因转移翡难度很大。其次， 农业栽培措施壶于受耕作制度和社会经济发展的限制，在生产中有效的实施仍有一定难度，使用化学或生物制剂防治烟草花叶病不失为一种经济有效的措施。 现有的药剂菌奇演、宁南霉素、病毒 A、病毒必克有一定防效(防效大多在 30,-60)，但药剂防治效果还不理想。植物病毒病是影响农业生产的重要因素之一，全世界每年因植物病毒病害所 造成的产量损失大约占粮食总产量的 10(Fras
15、er，1985)。有效地控制病毒的 为害是农业生产上的当务之急。迄今为止，几乎没有能有效地从感染病毒的植 物上除去病毒的化学药剂。有些化学药剂(如嘌呤、嘧啶类似物)能减缓病毒的 增殖，但无根除之效，而且常常比病毒更易伤害作物。近年来，植物源抗病毒制剂（生物源农药）由于其高效、低毒、无残留的特 点和优势，在植物病毒病害防治过程中发挥出越来越重要的作用。自 1925 年 Duggur 等从商陆(phytolacca）上发现第一个植物病毒抑制物以来14，陆续开 发了很多抗病毒制剂，像病毒 A、植病灵、金叶宝等。目前研究发现的抗病毒 活性物质，既有生物小分子的次生代谢产物，也有大分子的多糖、核酸和蛋白
16、 质等。其中蛋白质类活性物质广泛存在于自然界各种生物体内，包括植物、微 生物、动物等，最受关注，同时也是研究较多的一类活性物质。动物病毒广泛侵袭各类动物，对经济动物也不例外，在家禽家畜养殖中屡见 不鲜。在如今的抗动物病毒活性成分化合物中，主要都是黄酮类相关的化合物。 黄酮类化合物泛指具有 15 个碳原子(C6-C3 一 C6)的多元酚化合物，广泛存在于 自然界中。按结构可分为黄酮和黄酮醇类、双黄酮类、二氢黄酮及二氢黄酮醇 类、查耳酮类、异黄酮类以及其它黄酮类等。许多中草药的抗病毒活性成分都 是黄酮类化合物，如从甘草中分离出的黄酮类成分甘草素与异甘草素有很强的 抑制艾滋病病毒(HIV)能力，甘草香豆素属于异黄酮类的衍生物，甘草吡喃香豆 素等多种甘草黄酮类成分可抑制 H1V 诱导的巨细胞形成，且未见细胞毒性。自 从 1993 年首次从短叶红豆杉的韧皮部分分离到一株产紫杉醇的内生真菌后，研 究者就开始不断地从内生菌中分离出各种活性代谢产物，这其中就包括抗病 毒活性代谢产物。目前临床上常用的药物主要有如下几种：抗流感病毒及呼吸道病毒药物：抗
