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1、中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2005, 25(9):3539 研究报告 绿色荧光蛋白标记的表达载体 pHisEGFP 的构建*王伟孟超朱平程克棣* （中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所北京 100050）摘要为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤，构建了能在大肠杆菌中表 达融合蛋白的通用表达载体 pHisEGFP。该载体含有源自表达载体 pET32a 的 T7 启动子、 终止子和源自质粒 pUC18 的 ColE1 复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载体成功地表 达并纯化了酵母 GGDP(geranylgeranyl diphosphate,
2、 GGDP)合酶融合蛋白，结果表明所构 建的载体是一个实用的表达载体，并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的 方法。 关键词表达载体绿色荧光蛋白（EGFP）GGDP 合酶收稿日期：20050511 修回日期：20050618 * 国家自然科学基金资助项目（20172071） ，国家“863”计划资助项目(2001AA23402) * 通讯作者，电子信箱： 重组蛋白基因的表达是对克隆的目的基因编 码的蛋白质进行结构和功能研究的重要内容；一些具有生物活性并在医药、工业上有应用 价值的蛋白质，可以通过基因工程的方法克隆其编码基因并用适宜的表达系统大量表达而 获得1 。常用的基因表达系统有原
3、核表达系统和真核表达系统。大肠杆菌常常作为表达 重组蛋白的首选实验系统，因为大肠杆菌有操作简单、生长繁殖快、容易发酵培养等优点。 另外，对大肠杆菌的特性和遗传背景了解得相当清楚也是重要原因。大肠杆菌系统表达外 源基因产物的水平远高于其它的基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白 的 50%。因此，大肠杆菌是应用最广泛的合成异源蛋白的基因工程表达系统之一2 。目 前，使用最为广泛的原核表达载体有 pGEX 系列、pET 系列的载体。在利用这些表达载体进 行基因表达研究，制备活性蛋白时，常常遇到外源基因表达与否不能迅速得知，纯化过程 中对各分离组分需进行多次电泳检测，才能进行后续工作，很
4、花费时间。为便于重组蛋白 的检测和纯化，本研究利用绿色荧光蛋白为标记构建了一个可以直观地观察蛋白表达状况 及纯化情况的融合表达载体 pHisEGFP，并进行了酵母 GGDP 合酶的融合表达。 1 材料与方法 1.1 材料 宿主菌 E. coli DH5、pEGFPN1(Clontech)为本实验室保存；宿主菌 E. coli BL21trxB(DE3)和表达载体 pET32a 购自 Novagen 公司。克隆质粒 pUC 18T、Taq DNA 聚 合酶、各种限制性内切酶和 DNA 胶回收试剂盒购自大连宝生物工程公司，T4 连接酶和蛋白 亲和纯化凝胶 ProBand Resin 购自 Invi
5、trogen 公司，离子交换凝胶 DEAESepharose Fast Flow 购自 Amersham Biosciences 公司。 1.2 绿色荧光蛋白（EGFP）标记表达载体 pHisEGFP 的构建 1.2.1 质粒 pUC 18 的改造为使质粒 pUC 18 能连接来自表达载体 pET32a 的表达元件并保 留 Pst I 位点，需要消除原质粒中的 EcoR I、Sal I、Sph I 和 Nde I 等限制性内切酶位 点。 为此用 EcoR I 和 Sal I 酶切质粒 pUC 18 并用 T4 DNA polymerase 进行平端化，连 接转化后消除了 EcoR I 和 Sa
6、l I 位点；然后再用 Sph I 和 Nde I 酶切所得到的质粒，再 用 T4 DNA polymerase 进行平端化，连接转化后又消除 Sph I 和 Nde I 位点，得到质粒pUC/SESN。经过改造的质粒只保留了 pUC 18 质粒中原有多克隆位点的 Pst I 位点。 1.2.2 表达载体 pHisEGFP 的构建为能直接观察目的基因表达状况及方便融合蛋白的纯化， 构建了含绿色荧光蛋白标记的表达载体 pHisEGFP。为获得具正确读码框架的多克隆位点 及去除绿色荧光蛋白基因的稀有密码子，设计合成了多组引物（表 1） ，其中引物 EG5、EG9 分别引入了限制性内切酶位点 Xba
7、 I 和 Nco I。 多克隆位点的插入：以质粒 pET32a 为模板，用引物 EG1/EG2 进行 PCR 扩增得到含多克隆 位点及 T7 启动子等表达元件的 2 250 bp 的质粒 DNA 片段；再用 Pst I 位点把该片段亚克 隆到上述质粒 pUC/SESN 中，得到质粒 pEG12。 定点突变去除绿色荧光蛋白基因中的 6 个稀有密码子：绿色荧光蛋白基因中有 10 个编码脯 氨酸的稀有密码（CCC） ，为使该蛋白在大肠杆菌中能顺利表达，拟消除其基因中编码脯氨 酸的 6 个稀有密码，需要对荧光蛋白基因进行定点突变；为方便重组蛋白的纯化，引物设 计中在其 N端和 C端分别引入编码 6 个
8、组氨酸及肠肽酶切割位点的核酸碱基。以含荧光 蛋白基因3的质粒 pEGFPN1 为模板，用引物 EG3/EG4、EG4/EG5 两次扩增得到 240 bp DNA 片段。用引物 EG6/EG7 和 EG8/EG9 分别扩增得到 420 bp、150 bp 的 DNA 片段。这 3 个 DNA 片段通过 SOEPCR 方法4用引物 EG5/EG9 进行扩增得到含有绿色荧光蛋白 EGFP 的 792 bp 融合基因片段（图 1） ，这样就利用引物 EG4、EG6、EG7、EG8 共突变了 6 个编码脯 氨酸的密码 CCC 成 CCG；再用 Xba I 和 Nco I 酶切把该片段亚克隆到质粒 pEG
9、12 中，即构 建成含荧光蛋白标记的可诱导表达载体 pHisEGFP。 2005, 25(9)王伟 等： 绿色荧光蛋白标记的表达载体 pHisEGFP 的构建 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.9 2005 表 1 用于本研究的寡核苷酸Table 1The olinucleotide sequence in this study 引物序列 EG15CCTGCAGCAAAAAACCCCTCAAGACC3EG25CCTGCAGAATGAGTGAGCTAACTTACATTAAT3EG35GAGATATACATATGCACCATCATCA TCATCAtAT
10、GGTGAGCAAGGGCGAGGAG3EG45CGGCCACGGCACCGGCAGCTTGCCGGTGG3 EG55TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCA3EG65 CCGGTGCCGTGGCCGACCCTCGTGACCACC3EG75AGCAGCACCGGGCCGTCGCCGATCGGGG TGTTCTGCTGGT3EG85GGCGACGGCCCGGTGCTGCTGCCGGACAACCACTACCTGA3EG9 5CCCATGGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC3GGDP15CCCA
11、TGGAG GCCAAGATAGATGA3GGDP25CCTCGAGTCACAATTCGGATAAGTGG3 图 1 用 SOEPCR 方法扩增绿色荧光 蛋白 EGFP 基因片段 ： 编码脯氨酸的密码 CCCFig.1The fragment of gene encoding the green fluorescent protein was amplified by SOEPCR ： The sites of code of the proline of the gene 1.3 酵母 GGDP 合酶的表达 用酵母 GGDP 合酶的表达对构建的表达载体 pHisEGFP 进行了功能鉴定。酵母
12、 GGDP 基因的 亚克隆：以酵母的基因组 DNA 为模板，用引物 GGDP1/GGDP2 直接扩增得到 GGDP 合酶基因 5 ，经测序鉴定后把扩增得到的酵母 GGDP 合酶基因用位点 Nco I 和 Xho I 定向地亚克 隆到表达载体 pHisEGFP 中，得到 pHisEGFP/GGDPS。 酵母 GGDP 基因的表达：按照本实验室优化过的诱导表达条件对重组质粒 pHisEGFP/GGDPS 进行诱导表达6 。分别挑取单克隆 E. coli BL21trxB(DE3) /pHisEGFP 和 E. coli BL21/pHisEGFP/GGDPS，接种到氨苄青霉素浓度为 100g/ml
13、的 20ml LB 培养基中 37培养 12h，按 1%接种量转接到含 100ml LB 培养基（含氨苄青霉 素浓度为 100g/ml）中 37培养至 OD600 为 0.61.0，加入 IPTG（异丙基硫代D 半乳糖苷）使终浓度为 0.5mmol/L，在 16诱导培养 1620h，离心得到菌体沉淀。 为检测 GGDP 合酶的表达情况，取出 1.5ml 培养物离心得到沉淀，用 150l 无菌水重悬沉 淀，超声波破碎细胞，12 000g 离心去沉淀，取 10l 可溶蛋白在 100变性 5min。用 SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，电泳结束后用硝酸银染色，再与直接观察相互 印证。 1.
14、4 酵母 GGDP 合酶融合蛋白的分离纯化 离心收集菌体，沉淀用磷酸钠缓冲液（20mmol/L, pH7.2）洗涤一次，按培养物的 1/10 体 积加入磷酸钠缓冲液重悬菌体，超声波破碎细胞，12 000g 离心去沉淀；上清液先用离子 交换凝胶 DEAESepharose Fast Flow 进行初步分离，采用 0200mmol/L NaCl 磷酸钠缓 冲液进行梯度洗脱，直接收集含绿色荧光的洗脱部分，然后再经过 ProBand Resin 亲和层 析柱，用咪唑进行梯度洗脱，收集含绿色荧光的洗脱部分,即得到表达的酵母 GGDP 合酶融 合蛋白。 2 结果 2.1 基因表达检测载体 pHisEGFP
15、 的结构特点 构建的表达载体 pHisEGFP 是一个能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体，由于带 有绿色荧光蛋白基因，方便了基因表达的检测和重组蛋白的纯化（图 2） 。载体含有来自质 粒 pET32a 的 T7 启动子、终止子和来自质粒 pUC18 的 ColE1 复制子及绿色荧光蛋白报告 基因。 图 2 表达载体 pHisEGFP 的序列标记Fig.2pHisEGFP sequence landmarks T7 promoter 17011789; T7 transcription start 1790; Gfp 18112527; Enterokinase site coding s
16、equence 25282542; HisTag coding sequence 17931810; MCS, Nco IXho I 25442598; T7 terminator 26892735; lacI coding sequence 1313229; pUC sequence 1193, 27464999 表达的融合蛋白 N端含有 6 个组氨酸（His）便于进行亲和层析纯化；由于质粒 pUC18 中 rop 基因的缺失，构建的表达载体 pHisEGFP 的拷贝数高于质粒 pET32a 的拷贝数，易 于进行质粒的纯化。在质粒构建过程带入肠肽酶位点，纯化的融合蛋白经肠肽酶处理后即 可获得所需活性蛋白。 2.2GGDP 合酶的表
