细胞表面分子的检测与分析

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1、本次实验课流程n课件讲述 40min n实验演示 20minn流式细胞仪硬件及软件介绍 30minn上机检测 40minn解惑答疑 15min医学结构生物学研究中心柳卫凰细胞表面分子的检测与分析流式在细胞表面分子检测中的应用n免疫细胞及其亚群的检测与功能分析 例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等n血液系统细胞表面标志的研究 例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究 、血小板分析辅助诊断相关疾病等n细胞群体及细胞表面标志变化的监测 例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化n细胞表面标志构成性质的分析 例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析标本来源n外

2、周血全血溶血、PBMCn骨髓穿刺液体液、灌洗液n实体组织新鲜组织、石蜡包埋样本n培养的细胞原代细胞细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞一、新鲜实体组织样本的制备n 酶消化法。常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原 蛋白酶等n 机械法。1、剪碎法 2、网搓法 3、研磨法n 化学处理法。常用试剂：0.2%EDTA 0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化过程外，其余步骤最好在4度环境下操作，提高 细胞活性。标本制备标本制备二、全血标本的制备“ABC”溶血（Beckman）取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次 加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul, 轻轻振荡15

3、s； C液100ul, 振荡10s，免洗上机检测。“ACK”溶血（自配）以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混 匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反 复23次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标 记。标本制备三、外周血单个核细胞的制备（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀； （2）沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll，勿用力过大； （3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层 为分离液层，底层为红细胞层； （4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水洗两遍，PBS重悬； （5）荧光

4、标记。四、贴壁细胞单细胞悬液的制备（1）将培养细胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化37分钟，至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化 液，加PBS；（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中；（3）离心，1000r/min，5min；（4）加PBS洗两遍；（5）PBS重悬，将细胞吹打均匀；（6）荧光标记。标本制备标记方法n直接免疫荧光法特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。n间接免疫荧光法特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非 特异性染色，结果不易判断。（建议只用于单标检测）n直接、间接混合染色法染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直 接标

5、记。对照设置n阴性对照调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值 。常用的有：同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照n阳性对照检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。n空白对照确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。 n补偿对照多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。同型对照（Isotype Control）n用于消除由于抗体非特异 性结合到细胞表面的Fc受体 而产生的背景染色n与染色的单克隆抗体相同种属来源相同免疫球蛋白及亚型相同荧光素标记相同剂量和浓度由未免疫动物血清纯化而来双色标记荧光补偿口诀：横平竖直荧光补偿对照分析类型管功能 加入的抗体单色分析1Isotype1

6、-FITC2Sample1,2A-FITC双色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PE三色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC-PC55Sample1,2A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-ECD1- PC52Compensa

7、tion1A-FITC2a-PE1- ECD1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- ECD1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC- ECD1- PC55Compensation41-FITC2a-PE1- ECDD-PC56Sample1,2A-FITCB-PEC-ECDD-PC5注意事项n样本的采集、储存n样本的染色n全血样本的溶血效果n流式实验对照的设置样本的采集n 手术切除的新鲜标本取材 时，要避免出血或组织坏 死 。深低温保存，以免组织发 生自溶，DNA降解，造成检 测结果的误差。n 采集静脉血样本时，要避 免发生溶血。n 收集培养的

8、细胞时，要注 意选择消化的方法和试剂。样本的储存原则：时间越短越好n肝素抗凝的外周血和骨髓：室温 72小时nEDTA抗凝的标本：室温 24小时nACD抗凝的外周血：室温 72小时nACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝n粒细胞、血小板功能检测：即刻检测n单核细胞表面抗原分析： 1小时，4n嗜酸性粒细胞表面抗原分析： 24小时，4n淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析： 72小时样本的染色n影响抗原抗体反应的因素电解质、反应温度与时间 、PH值（7.27.4）n流式抗体的选择根据流式细胞仪的类型选择抗体抗体应用级别、滴度和使用量的选择根据抗原表达量选择抗体溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白 细胞的

9、先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分 开，溶血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶 血过程进行严格控制。全血样本：溶血效果很重要影响溶血的因素：采血过程溶血剂的使用实验操作过程结语n流式细胞术的样本制 备没有一个黄金标准n最佳样本制备方法需 要根据具体情况独立设 定评估常用的荧光染料荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP

10、 488 670 免疫荧光 深红参考书籍n实用流式细胞术彩色图谱王书奎主编 n流式细胞术基本原理与实用技术梁智辉主编n临床流式细胞分析 王建中主编n流式细胞术 杜立颖主编实验：人外周血T淋巴细胞亚群的检测与分析淋巴细胞单核细胞粒细胞这三群细胞分别由具有不同功能的细胞组成 这些细胞数量不等，甚至非常稀少 这些细胞表达不同的标记物，是用来区分它 们的基础T淋巴细胞(CD3+)名 称功 能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th) 诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫 诱导细胞免疫和体液

11、免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8- 有调节功能的T细胞,其表达 / T细胞受体(TCR / ) CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO- 幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+ 记忆性T淋巴细胞 病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染,

12、 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高活化T淋巴细胞名 称功 能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味着 HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+ 活化的B细胞过敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B细胞白血病及单克隆B

13、淋巴细胞 NK细胞 CD3-CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低, 而病毒感染时升 高 CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆 1.取新鲜抗凝血100ul，置于FCM测量管中；2.直接标记法：加入带荧光标记抗人的单克隆抗体 10ul，充分混匀，4闭光孵育2030min; 3.加入溶血剂A液600ul, 轻轻振荡15s,加入溶血剂B液260ul, 轻轻振荡15s，加入溶血剂C液100ul, 振荡10s,上机检测。ACK溶血剂:加入2mlACK溶血剂，充分混匀，反应5min, 1000r/min离心5min，去上清；重复一遍，用PBS洗涤1遍，收集细胞上机检测。实验步骤ABC溶血

14、剂配方nA: 0.12%甲酸 (超纯水配置)nB:碳酸钠 6.0g/L ; 氯化钠14.5 g/L ;硫酸钠 31.3g/L (超纯水配置)nC:多聚甲醛 10.0g/L( PBS配置) ACK溶血剂配方n150mM(8.025g) NH4Cl n10mM (1.01g) KHCO3n0.1mM (0.0372g) Na2EDTAn调PH至7.2-7.4，定容至1000mln无菌滤膜滤过，4保存实验分组nA:同型对照管或空白对照(调节电压)nB: 单标补偿管(电压不变,调节荧光补偿)nC: 双标样本检测管荧光补偿“A门”内CD3/CD4的表达“A门”位置变化引起的改变“A门”位置变化引起的改变小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达思考题、实验报告1、同型对照、空白对照、补偿对照各有什么 意义？ 2、多色荧光标记时如何设置对照？ 3、样本处理过程中要注意哪些事项。实验报告：请根据你科研的需要设计一个完 整的流式实验。内容包括：实验原理、材料 与方法、实验步骤、实验结果等。Thank you！