《PI染色法测细胞周期》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PI染色法测细胞周期（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PI染色法测细胞周期n正常人静止体细胞有46条染色体，相当 于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之 为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在 不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1， S，G2 ，M)的各个时期，DNA含量随各 时相呈现出周期性的变化：在G1期，细 胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量 仍保持二倍体；n进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA 的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成 为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合 成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯 从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分 裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子
2、 细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静 止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与 G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为 G0/G1，S，G2/M期。n通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞 仪进行分析，可以得到细胞各个时期的 分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百 分含量，了解细胞的增殖能力；结合 DNA指数分析，还可进行凋亡、异倍体 等检测。GG2 2MMGG0 0GG1 1 s s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1s sGG2 2MMDNA AnalysisDNA AnalysisDNA contentC o u n t2N2N4N4NNorm
3、al Cell Cycle n染料的选择取决于流式激光的配置。 488nm的激光下应用PI(碘化丙啶)，由 于PI也与RNA结合，所以分析前样本应 用Rnase处理.。重要的是染料要足够， 以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少 20ug/106 个细胞。其最佳浓度为 50ug/106 个细胞。细胞浓度及质量要求n单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓 度太低，上机时样本的流速不得不提高 ，这样就会影响检测的CV。浓度太高， 则可能导致染料的相对不足，最终使染 色不饱和，同样影响CV和检测结果。n制备完成后的标本应用光学显微镜检查 其质量：细胞是否聚集或过多的碎片。操作步骤 n取一瓶生长期的A
4、549细胞，倒掉瓶中旧的培 养液，加入3mlPBS，细胞生长面在下轻轻晃 动细胞瓶，然后去掉液体，加入1ml胰蛋白酶 消化15分钟（以镜下观察决定）n加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面，制成细胞 悬液，将细胞悬液移至15ml离心管中 1500rpm离心5min，去上清。n加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液， 在旋涡状态下逐滴加入2ml-2095%冷乙醇 ，混匀后固定30min。n加入5mlPBS，1500rpm离心5min，去 上清液。n加入5mlPBS重悬细胞，1500rpm离心 5min，去上清液。n加入800ulPI染液，用枪轻轻吹打细胞 团，混匀，室温避光染色30minn上机
5、检测。影响荧光染色的因素 n温度：温度高于20时，即出现温度淬 灭。n2、PH：PI在7.27.6，保持荧光染料 分子与溶剂间的电离平衡。n3、荧光染料浓度：染料太少，结合不 完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现 象。n4、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性 染料与核酸分子的结合，造成荧光发射 强度减弱。什么是流式细胞仪n流式细胞仪(Flow Cytometer 简称FCM) 是一项集激光技术电子物理技术光 电测量技术计算机技术以及细胞荧光 化学技术单克隆抗体技术为一体的新 型高科技仪器。什么是流式细胞术n简单说就是自动化的萤光显微镜n测定分析悬浮于液流中的颗粒在通过激 光束时发出的光学信号的一个系
6、统流式细胞仪特点及检测标本n特异性强，灵敏度高，速度快，并能实 现多参数分析；n可检测的样本种类多样n(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实 体组织，培养细胞n(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液流式细胞仪的结构n液流系统n将细胞引导至检测点n光学系统n产生并收集光学信号n电子系统n将光信号转换成电信号，使之数字化，输 入计算机并分析n分选系统液流系统n流动室n鞘液n酸碱平衡的电解液，可选PBS、血球稀释液 或蒸馏水。n样本流n单细胞悬液，浓度51051 106/mL液流系统n-FLOW CELL(流动室)：是仪器的核心部件 ，被测样品在此与激光相交。Injector Tip荧光信号聚焦的
7、激光光束鞘液光学系统n光学激发系统n激光激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种 相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高 的光照n488nm，635nmn光学信号n光学收集系统n光学滤片n透镜光学信号n光学信号有两种n1.散射光信号：前向角散射光 (FSC,Forward Scatter) 侧向角散射光(SSC,Side Scatter)n2.荧光信号(488nm,635nm)光学信号n信号产生-散射光信号n当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个 方向散射。与激光束方向同轴的称前向角 散射光
8、信号（FSC）。与激光束垂直的称为 侧向角散色光信号（SSC）。光学信号光学信号n信号产生n前向角散射光信号(FSC)：反应了细胞或颗 粒大小的不同。n侧向角散射光信号(SSC)：反应了细胞或颗 粒内部的复杂程度或颗粒性的不同。n散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（ 如染色），因此被称为细胞的物理参数， 反应细胞的大小和内部结构。前向角散射光信号侧向角散射光信号n双参数散点 图信号产生-荧光信号n荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光 束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回 基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。这种发射出的光称为荧光。n荧光信号荧光信号荧光信号光学收集系统nFCM的光学
9、系统是由若干组透镜, 滤波 片, 小孔组成光学收集系统n滤片n长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过 ，并反射短于设定波长的光n短通滤片(SP):只允许特定波长以下的 光通过。流式细胞仪带通滤片（BP）：允许一定带宽波长的光 通过。光学系统基本图形n单参数直方图：细胞每一个单参数的测 量数据可整理成统计分布，以直方图来 显示。n双参数数据图：用于表达同一细胞两个 参数与细胞数量间的关系。流式细胞术的应用n细胞生理学研究n细胞膜表面标记n胞内标记n细胞周期分析n凋亡分析n分选nCBA细胞生理学研究n细胞相对大小和颗粒性n胞内pH值检测nCa+流动性检测n膜电势检测n细胞活性检测n细胞活力(增殖能
10、力)的检测荧光信号的面积和宽度n所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通 量进行积分测量，一般对DNA倍体测量 时采用面积（如FL2-A),这是因为荧光 脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确 反映DNA的含量，当形状差异较大，而 DNA含量相等的二个细胞，得到的荧光 脉冲高度是不等的，经过对荧光信号积 分后，所得到的信号值就相等。n宽度（FL2-W）常用来区分双联体细胞 。由于DNA样本极容易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2期细胞相等， 这样得到的测量数据G2期细胞比例会增 高，影响测量准确性ModFit LTn是由美国Verity Software House 公司设计 ，专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析 的软件。它通过对DNA 含量直方图进行曲线 拧合，能快速计算出分析细胞周期各时相细 胞的含量、G1/S/G2+M 细胞的百分比，并测 量肿瘤细胞的DNA 指数 (DNA Index)、及分 析凋亡细胞亚二倍体所占的比例。此外，2.0 版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析 ”的功能，可分別进行同步化细胞和增值细 胞的研究 (Synchronized or Drug- Perturbed Cells)
