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1、 检测原理介绍体外诊断定义n体外诊断是通过特定的实验方法对实验室采集的人体样本（各种体液、细 胞、组织样本等）进行定性或定量分析。n体液包括l血液l尿液l粪便l唾液l其它2体外诊断的分类n常规体外诊断包括：l临床常规检验-血常规、尿常规l临床生化检验-血脂、肝功能、肾功能l临床免疫检验-乙肝、HIV、甲状腺功能l临床微生物检验-细菌培养、细菌鉴定3体外诊断的分类n常规体外诊断包括：l临床常规检验-血常规、尿常规倾向于检测体液中的有形成分，通过仪器等可以看到起形态，如血细 胞的形态，血细胞计数等。l临床生化检验-血脂、肝功能、肾功能l临床免疫检验-乙肝、HIV、甲状腺功能生化和免疫检验用于检测体
2、液中的一些特殊物质，这些物质无法看到 其形态，但在体内保持特有的生化和免疫特性l临床微生物检验-细菌培养、细菌鉴定4待测物质浓度与检测手段临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析 药物浓度监测甲状腺激素性激素过敏原 心血管标志物 传染性疾病 维生素 血清蛋白常量微量超微量5肝炎系列肿瘤标记性激素特定蛋白TDMs/药物 甲状腺, 贫血HBV HCV分 子 量1071010-1510-4 g/L （浓度） AFP FER CEA CA199PRL HCG LH FSH GH MyoglobinRHF IgG C3 ASO CER
3、TRF AAGQUIGEN AMIPHYFT3 FT4 DigT3 T4 TSH Prog免疫分析物图不同分析物分子量与体液中浓度列表Eclectica的检测原理n方法学l免疫：磁微粒免疫定量分析l生化：终点法、动力学法、两点法l特定蛋白：免疫比浊法7n在20世纪80年代初，瑞士Serono诊断公司（亚特斯公司前身） 研制出 “磁微粒分离免疫测定（MAIA）” 专利技术（美国专 利号：4659678），成为于20世纪90年代起在全球得到广泛应 用的微粒子或磁微粒分离化学发光免疫分析的基础技术 n是目前最优的一种微粒子分离技术，该技术是利用制备出的直径为微米级（2-3m）的活性超顺磁性微粒均匀悬
4、浮在 液体之中磁微粒表面大量偶联了特异性抗体与被分离物进行快速的特异性结合用外加磁场将结合有被分离物的磁微粒沉降吸附下来清洗去掉其它杂质最终仅获得磁微粒与被分离物的特异性复合体磁微粒与被分离物用特殊手段可进一步分离什么是“磁微粒分离技术”？8磁微粒分离载体技术要点改性后Fe3O4纳米粒子 与水的接触角124.5ou 具有可与蛋白特异性反应 （联结）的生物活性u 高亲水性：具有在水溶液中 可持久悬浮的亲水性u 高顺磁性：具有可被磁力 迅速聚集超顺磁性u 高单分散性：具有不会因 剩磁而团聚的但分散性9磁微粒分离技术相比微孔板分离的技术优势n优化成准液相反应n反应面积、几率大大增加，从而增加反应速度
5、n制备的试剂具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、结果准确 可靠的特点磁微粒分离技术是目前在异相标记免疫分析法应用中最先 进的分离技术10磁微粒分离技术在定量免疫分析中的应用n基于 “磁微粒分离免疫测定 (MAIA) ” 技术的标记免疫 分析产品可更加敏感、准确的测定体内微量活性物质：内分泌激素蛋白质微生物抗原/抗体核酸神经递质受体细胞因子肿瘤标记物细胞表面抗原血药浓度等n进一步加强对基础医学、临床医学的发展11磁微粒分离技术在定量免疫分析中的应用n目前已发展l磁微粒分离放射免疫定量检测试剂l磁微粒分离酶免定量检测试剂l磁微粒分离化学发光定量检测试剂l磁微粒分离电化学发光定量检测试剂n市场上应用该
6、技术的主要产品lRoche E170 全自动免疫分析仪lAbbott i2000 全自动免疫分析仪lAdaltis Eclectica 全自动磁微粒免疫定量分析仪lBayer ACS180 全自动免疫分析仪12Eclectica免疫检测的性能特点-MAIA技术nEclectica免疫分析采用亚特斯专利的磁 微粒分离免疫技术（MAIA）l采用Fe3O4核心的磁微粒为固相载体磁性微粒 表面积大，蛋白吸附能力极强，与包被管或包被珠 相比反应表面积增大50倍是目前最理想的免疫固相 分离载体之一。l磁微粒增进了结合动力并保证了较大的敏感度。分 散悬浮液的反应速率接近均相溶液的动力学，同時 抗原抗体的相对
7、反应浓度增高，增快了捕捉的有效 性，提高了精确度，加快了免疫反应的速度。l采用磁场磁性分离技术。磁铁吸附住磁微粒，能更 有效的将游离相和结合相分离。13Eclectica免疫检测的性能特点-反应模式示例14Eclectica免疫检测的性能特点-FITC标记采用 FITC标记抗原或抗体 一个免疫球蛋白分子可以和1520个FITC分子结合将反应系统结合能力提高了1520倍。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免 疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键， 成为标记荧光免疫球蛋白，一个Ig分子最多能标记15 20个FITC分子。异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy
8、nate,FITC) 15Eclectica免疫检测的性能特点-ALP标记采用高纯度，高特异性的ALP标记抗原或抗体底物液为磷酸酚酞盐（phenolphthalein monophosphate）ALP使磷酸酚酞盐脱去磷酸基团使酚酞的显 色基团游离出来，而变成粉红色终止液为强碱性溶液加终止液后溶液粉红色加强,在546nm下有 最强吸收峰.490nm下光度值是546nm下的光度值的1/4.碱性磷酸酶（alkaline phosohatase，ALP）16Eclectica免疫检测原理-夹心法原理n夹心法（适用于二价及以上大分子量抗原如FSH、 TSH、AFP）nFITC标单克隆抗体 酶标单克隆抗
9、体l试剂瓶中成分为以上两种抗体的混合物l酶标单克隆抗体，FITC标单克隆抗体分别与标本抗 原的不同部位结合，形成夹心复合物第一步：形成双抗夹心复合物FITC标 记抗体被分析物酶标记 抗体 +双抗夹心 复合物 +未结合部分17Eclectica免疫检测原理-夹心法原理l磁微粒联接的抗荧光素抗体与免疫复合物中的荧光素结合，形成磁微粒-抗 荧光素抗体-荧光素标抗标本抗体-标本抗原-酶标抗体聚合物抗荧光素(FITC) 的磁微粒 游离过剩的 酶标抗体 过剩的FITC标 记抗体 第二步 加入磁微粒，复合物连接到固相载体+ +反应混合物连接到磁微粒的酶 标抗体18Eclectica免疫检测原理-磁性分离反应
10、杯 磁铁 注液针抽液针1.加入待测样本2.加入含两种抗体的试剂3.温育，形成双抗体夹心复合物4.加入磁微粒5.温育，ALP标记物通过待测抗 原连接到磁微粒上6.磁体贴近反应杯吸附磁微粒 7.清洗针深入反应杯洗去游离未 结合的ALP标记物8.移去磁体和冲洗针19Eclectica免疫检测原理-显色和测量到测量池磁铁 1.加入底物-磷酸酚酞盐2.ALP使底物变为粉红色3.加入终止液，粉红色加强并稳定 下来4.磁铁贴近反应杯吸附磁微粒5.吸液针深入反应杯将反应液吸 入测量池进行测量6.移去磁铁和吸液针20Eclectica免疫检测原理-竞争法原理n竞争法（适用于细小的抗原分子检测如T3、T4、E2）
11、l标本抗原和FITC结合的抗原衍生物竞争酶标抗体l标本抗原与FITC抗原衍生物相互竞争抑制l若标本抗原含量大，则FITC抗原衍生物与酶标抗体结合小，反之则与之结合 大21Eclectica免疫检测原理-竞争法原理第一步：形成抗原抗体复合物FITC标 记抗原被分析物酶标记 抗体抗原抗体 复合物+l与待测抗原同源的FITC抗原衍生 物和待测抗原竞争性结合酶标抗体22Eclectica免疫检测原理-竞争法原理l磁微粒联接的抗荧光素抗体与免疫复合物中的荧光素结合，形成磁微粒-抗荧 光素抗体-荧光素标抗标本抗体-标本抗原-酶标抗体聚合物抗荧光素(FITC) 的磁微粒 游离酶标抗体 待测抗原复合物+ +反
12、应混合物通过FITC衍生物连接 到磁微粒的酶标抗体第二步 加入磁微粒，复合物连接到固相载体 第三步 磁场磁性分离 第四步 加底物显色，光度值与待测物浓度成反比23Eclectica生化检测原理-终点法l终点法 End PointEnd Pointl此方法是将样品与试剂保温一段时间后，全部转变成可监测的化合物，然 后测定后者的总量来计算样品的浓度。 24l终点法 End Point End Point Eclectica生化检测原理-终点法的计算方法标准法：是最常用到的计算方法之一。因子的计 算公式如下：C =C = 样品吸光值 * 标准浓度 / 标准吸光值所有的终点法都必须通过测量标准品来定标
13、计算。25l动力学法 Kinetic 又称为 速率法 或 酶法l动力学法无需定标。需采用固定的因数。Eclectica生化检测原理-动力学法的计算方法因子法：是最常用到的计算方法之一。因子 的计算公式和样品浓度的计算公式如下：F = 1000 * TV / SV * E * P C = F * Abs.(F-因子 TV-总体积 SV-样本体积 E-摩尔消光 系数 P-比色杯光径 Abs.吸光值变化率)常用项目中的大都酶类的检测可采用因子法， 但尿素氮、肌酐例外 26Lag phaseMeas. interval Absl动力学法 KineticKinetic利用反应速率来定量其浓度。Eclec
14、tica生化检测原理-动力学法27l动力学法 Kineticl动力学法无需定标。需采用固定的因数。Eclectica生化检测原理-动力学法因子法：是最常用到的计算方法之一。因子 的计算公式和样品浓度的计算公式如下：F = 1000 * TV / SV * E * P C = F * Abs.(F-因子 TV-总体积 SV-样本体积 E-摩尔消光 系数 P-比色杯光径 Abs.吸光值变化率)常用项目中的大多数酶类的检测可采用因子法 ，但尿素氮、肌酐例外 28DA/min x TVx1.000 DA/min x 2,200 x 1.000 U/L=- =- = DA/min x 1768e x d
15、 x Vs 6,22 x 1 x 0,200U/L =AST 浓度 U/LDA/min=每分钟吸光度变化率 (平均三次以上读数)TV=总反应体积1.000=体积转化为L的换算因素e=NADH+H+ 的毫摩尔吸光系数(6,22cm2/mmole at 340nm)d=测量池的光径Vs=待测样本的体积Eclectica生化检测原理-动力学法 l例如：AST检测的换算因数29Eclectica生化检测原理-两点法l两点法 Fix TimeFix Time （又称为固定时间法）30Eclectica生化检测原理-两点法l两点法 Fix TimeFix Time （又称为固定时间法）l可理解为需要定标的动力学法l仅尿素氮（BUN）和肌酐（CreaCrea）的检测采用此方法l两点法检测必须使用标准品定标Crea 浓度 (mg/dL)DA/min 样本 = - x Crea标准品浓度. DA/min 标准N.B. DA = EA2 EA131Eclectica特定蛋白检测原理-免疫比浊法透射免疫比浊法由于待检样品中的抗原与其对 应的抗体反应形成复合物使其 浊度增加，透过的光强度减弱 。透过的光强度减弱的程度与 抗原的量成一定的数量关系， 通过这一数量关系可从透过光 强度的变化来求知抗原的量。 胶乳增强比浊 将待测物质相对应的抗体包被在直径 为1560nm的
