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1、河北医科大学硕士学位论文单次灌胃杂色曲霉素对小鼠大脑细胞影响的研究姓名：刘晋红申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：张祥宏;王凤荣2003.3.1中文摘要单次灌胃杂色曲霉素对小鼠大脑细胞影响的研究摘要目的：杂色曲霉素( S T ) 是杂色曲霉、构巢曲霉等真菌产生的毒性代谢产物，也是我国恶性肿瘤高发区居民饮食中的主要污染霉菌毒素之一，对人和动物有明显的致癌性和致突变性。但目前s T 的毒性实验多是在体外进行的，诱癌实验所用的杂色曲霉培养物也难以排除其它致癌物的存在。机体是一非常复杂的生物学系统，许多致癌物必须通过机体的代谢才能发挥其致癌作用。同时，机体在消除致癌物的致癌性方面也发挥
2、着重要作用。因此，了解在整体水平上通过饮食途径( 经口) 给予纯化s T 对实验动物的生物学效应十分必要。本研究室在进行长期诱癌动物实验过程中发现s T 处理组小鼠有神经系统功能障碍表现，但有关S T 对脑组织生物学效应的研究于国内外均未见报道。本研究分析了经口给予S T 对小鼠大脑神经元的影响，旨在探讨饮食S T 暴露对小鼠脑组织的生物学效应，进而对S T 暴露对机体的危险性做出评估。方法：进行动物实验制造模型，实验分两部分进行。实验I ：将3 0 只B A L B c 小鼠随机分为5 组，对照组和不同剂量S T 处理组，每组6 只，雌雄各3 只。处理组分别 按S T3 l a g k g
3、、3 0 9 9 k g 、3 0 0 I t g k g 和3 0 0 0 耻g k g 的剂量，溶于0 5 m l 生理盐水中灌胃。对照组用等量生理盐水代替。灌胃1 2 h r 后将小鼠脱颈处死，迅速留取视交叉后缘至大脑中文摘要脚前缘部分脑组织，从大脑纵裂处平均分为两部分，分别用1 0 甲醛缓冲液和7 0 乙醇固定，待制备石蜡切片进行常规H E 染色与免疫组织化学染色和单细胞悬液进行细胞凋亡和增殖的F C M 检测：实验I I ：将4 8 只B A L B c 小鼠随机分对照组和s T 处理组，每组2 4 只，雌雄各半。实验组和对照组分别以剂量为3 0 0 0 p g k gS T 溶液0
4、 5 m l 和等量 生理盐水灌胃，方法同前。两组动物分别于灌胃后6h r 、1 2h r 、2 4h r 和4 81 1 r 各取6 只小鼠( 雌雄各3 只) 脱颈处死，立即取脑，待测( 同实验I ) 。石蜡切片制备4 张，l张用于常规H E 染色进行病理形态学观察分析，其余用于 免疫组织化学染色，每例均用免疫组织化学U l t r a S e n s i t i v e MS - P 方法检测c f o s 、b c l 一2 、b a x 基因的蛋白表达。单细胞悬液进行细胞D N A 染色，用于大脑神经元凋亡与增殖的流式细胞定量检测( F C M ) 。结果：1 病理形态学观察：H E
5、染色光镜观察可见，对照组小鼠大脑组织未见明显异常，而灌胃小剂量S T( 3 p g k g ) 后1 2h r 和3 0 0 0 p g k gS T 后6h r 即可导致小鼠大脑皮质、丘脑、海马区神经元出现一定程度的退行性病变，以海马C A 2 区最为显著，表现为部分胞核形状不规则，体积缩小，染色加深，核膜及核仁结构不清，胞浆嗜酸性变，有些可见空泡变化，且随剂量增加和作用时间延长，病变神经元逐渐增多。光镜下对病变较明显的海马C A 2区病变神经元进行计数分析，结果表明S T 处理组发生病理变化的神经元比例均高于相应对照组，且随着剂量的增加和作用时间的延长，L L 侈, J 逐渐增高( n =
6、 6 ，r = O 7 1 8 , P 0 0 5 ，表1 1 ) 。3 2 2S T 处理不同时间对小鼠大脑神经元细胞增殖指数( P I ) 的影响相同剂量S T ( 3 0 0 0 p g k g ) 处理后，在6 4 8 h r 的时间范围内，实验组大脑神经元的细胞增殖率均高于对照组，但差异无显著的统计学意义( n = 6 ，P 0 0 5 ，表1 2 ) 。讨论探讨霉菌毒素对机体的生物学效应是阐明饮食霉菌毒素暴露危险性的重要环节。s T 是杂色曲霉菌等真菌的毒性代谢产物，通过基因毒性而致癌H ”，也可作为黄曲霉毒素B 1 ( A f l a t o x i nB l ，A F B l
7、) 的前体转变成A F B l 对动物和人类产生致癌和致突变效应。已有报道S T 可明显诱发和加速体外培养的人外周血单个核细胞凋亡的发生，抑制I L 2和I F N Y 的分泌，从而影响机体的免疫功能；单次灌胃S T 可明显促进小鼠肝肾细胞的凋亡并对睾丸和卵巢的细胞周期有明显的影响【8 02 1 。但有关s T 对脑组织的生物学效应的相关研究于国内外均未见报道。研究发现一些霉菌毒素对脑组织可以产生严重的损害。变质甘蔗中毒发病急剧，病情凶险，预后危重，死亡率高，其原因就是食用霉变甘蔗后引起中枢神经系统损伤所致。现已证明导致甘蔗霉变的病原菌为节菱孢霉菌( A r t h r i n i u ms
8、a c c h a r i c o l a ) ，该菌可产生强烈的嗜神经毒索，患者主要表现为中枢神经系统受损 1 3 , 1 4 l 。伏马毒素f 烟曲霉毒素，f u m o n i s i nB l ，F B l ) 也可引起动物严重的多脏器病研究论天变，包括马的脑白质病变训。本研究采用动物实验、病理形态学观察、免疫组织化学染色和流式细胞定量检测技术相结合的方法研究了经口给予s T 后小鼠大脑神经元的变化。病理形态学观察结果发现与对照组相比，单次灌胃小剂量S T ( 3 9 9 k g ) 后1 2 h r 和3 0 0 0 _ t g k gS T 后于短时间( 6 h r ) 内即可导致
9、小鼠大脑内皮质、丘脑、海马区神经元出现退行性病变，以海马C A 2 区最为显著，表现为细胞核形状不规则，体积缩小，染色加深，核膜及核仁结构不清，胞浆嗜酸性变，有些可见空泡变性。随着剂量的增加和作用时间的延长，病变逐渐加重，表明s T 对小鼠大脑细胞确实有一定毒性作用。C - f o s 是即刻早期基因家族的一员。在正常情况下c f o s及其蛋白产物只维持基础细胞水平而不易被检测到，参与细胞的生长、发育、分化、记忆和信息传递等过程，足联系细胞生化改变与细胞最终对刺激发生特异性反应的中介物 15 , 1 6 , 1 7 1 。多种不同的生理和病理性刺激可诱导产生c f o s原癌基因及由其编码的
10、核磷酸蛋白( F O S ) 使之在中枢神经表达1 1 8 , 1 9 1 。外周的伤害性刺激通过神经递质、激素、神经冲动等可在数分钟内诱发中枢神经内与此刺激信息传递及调控有关的神经细胞表达F O S l 2 0 1 。因而，F O S 表达作为中枢神经对伤害性刺激反应的标志，可用以研究各种刺激诱导下的中枢神经元功能活动状态1 2 1 】。有研究对c f o s 阳性神经元进行了超微结构观察，发现神经细胞的c f o s 基因异常表达时，其超微结构会发生改变，提示c f o s 基因表达变化与神经元功能及结构改变有密切关系【2 2 l 。研究论文本实验发现单次灌胃S T 后，对照组未见阳性产物
11、，各处理组c F o s 蛋白免疫组织化学染色均呈阳性，6 h r 即有表达，至1 2 h r 达到峰值，之后随时间延长而逐渐减弱；并随剂量增加表达增强。统计学分析s T 各处理组海马区c F o s 蛋白免疫反应物质阳性率与相应对照组相比较，差异均有显著的统计学意义( n = 6 ，P 0 0 1 ) ，表明S T 作为一种毒素，确实可对小鼠脑组织产生伤害性刺激作用，导致c f o s 原癌基因表达异常，其超微结构的改变有待于进一步研究。 b c l 2 是B 细胞淋巴瘤白血病。2 ( Bc e l ll y m p h o m “l e u k e m i a ) 基因的缩写形式。原癌基因
12、b c l 2 是T s u j i m o t o 等1 9 8 5 年从伴有t ( 4 ，1 8 ) 染色体易位的滤泡状B 细胞淋巴瘤中发现的，定位于1 8 q 2 1 ，大约长2 3 0 k b ，含有3 个外显子和2 个内含子，与c e d 9 基因有2 3 的同源性，编码一个2 6 1 0 3 的蛋白。B c l 2 蛋白是一种膜整合蛋白，存在于细胞的线粒体膜、核膜、内质网膜上。B c l 2 蛋白的生理功能主要是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，对细胞周期和分化不产生影响【2 3 1 。这对于维持体内某些需长期生存的细胞如神经元、免疫记忆细胞、造血干细胞等的寿命具有重要意义 2 4 -
13、2 9 】。b c l 2 过量表达可延长神经元存活时 洲3 0 J 。将表达b c l 2 的质粒显微注入依赖于生长因子的神经元，可防止去除生长因子诱发的细胞凋亡，如用反义R N A 降低b c l 2 基因表达，则可加速细胞凋亡【3 1 1 。在研究B c l 2 蛋白及其作用机制时，O l t v a i 用免疫共沉淀法发现一个由1 9 2 个氨基酸组成，分子量约为2 1 K D 的B c l 2 相关蛋白，命名为B a x 3 2 , 3 3 1 。编码B a x 蛋白的基因b a x研究论文在脑内广泛表达，有2 1 的氨基酸与b c l 一2 同源，但功能与b c l 一2 相反。研
14、究袭明，b c l 一2 与b a x 可分荆形成丽二聚体，也可捆互形成异二聚体。B a x 蛋白与B c l ，2 蛋白比馕与细胞受刺激后是凋亡还是存活有密切关系：B a x 增高，促进缨麓凋亡；B c l 2 增高，辩镧缀澹撼亡t 3 4 , 3 5 t 。 本研究发现S T 各处理组海马区神经元B c l 2 与B a x蛋臼阳性表达率较相应对照组均有所增加，随S T 剂鬣增加( 3 3 0 0 0 端茂g ) ，B c t 2 与B a x 蛋自阳悭表达率毙悠也增加；但随作用时间延长( 6 4 8 h r ) ，B c l 2 与B a x 蛋白阳性表达率比值鏊下降趋势，表明S T 作
15、糟后，短时阚内b c l 2由于具有维持纲胞存活作用1 3 6 1 ，表达增加，藤B c l 一2 蛋皇的商表达激活了细胞凋亡系统中的某种负反馈机制，该系统遥过上调B a x 蛋舀表达来抵消B c l 。2 蛋白的抑镧细藏凋亡作用，从而促进细胞凋亡。故随作用时间延长，小鼠大脑神经元总的趋势是走向凋亡。F C M 结果袭暖S T 霹骥显健进小惑大脑缨戆蠲亡，显随着剂量的增加及作用时间的延长其促进凋亡的作用也逐渐增强，与B c l m 2 与B a x 蛋白免疫组织化学染色结果相符，表明经口给予S T 可以诱导并健遴小甄大煽细胞塌亡，数有关S T 对脑组织生物学效应的相关研究应予以重视。缀藏捅亡怒
16、控籁神经系统生长、发育动态平德的必要手段。发育过程中的神经细胞凋亡是保证机体正鬻发育积维持生理过程所必需的，而分化成熟的神经细胞过度凋亡烈楚病理性损害酶表现之一。在成熟酶神经系统中，特定的条件( 如毒素) 可扁动细胞凋亡【3 “ 。已有研究认为c 。f o s原癌基因在神经元凋亡中超着重瑟作用3 8 1 。C - f o s 原癌基因研究论文的表达可能对神经细胞凋亡的启动是必须的。有证据显示，c f o s 原癌基因的持续表达在细胞形态学死亡前数小时或数天即开始3 9 1 。另有资料表明：c f o s 原癌基因能使细胞由G 。期启动而进入细胞周期。在细胞周期中，细胞周期蛋白必须与相应的细胞周期依赖蛋白激酶结合，并经磷酸化脱磷酸化修饰后方具活性，继而促使与周期有关的蛋白基因如c f o s 等I E G s 表达，从而决定了对细胞周期的进程，c f o s 同时正负调控细胞周期的各阶段。如果c f o s 基因及其蛋白产物表达不合
