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1、1鉴别胆碱酯酶亚型的寡配体试剂盒鉴别胆碱酯酶亚型的寡配体试剂盒中国科学院孙曼霁院士一、一、项目名称：项目名称：鉴别胆碱酯酶亚型的寡配体试剂盒二、立项背景二、立项背景1、神经管缺损的发生神经管缺陷症(Neural tube defects，NTDs)是胚胎在妊娠第2428 天期间因神经管闭合受阻所致的一系列严重畸形，是我国高危、高发畸形之一，也是围产儿死亡和致残的主要原因，约占我国先天畸形的 20%25%。神经管缺损儿出生素质差，围产期病死率高，预后不良。加强预防和产前诊断是降低发生率的有效措施。2、神经管缺损诊断方法1）现有的诊断方法（1）B 超检查法；（2）母血及羊水甲胎蛋白（AFP）检查法
2、；（3）羊水 AChE 酶活性检测：正常羊水不含 AChE，神经管缺陷胎儿的脊髓和脑组织暴露在羊水中时，羊水中则出现 AChE，但羊膜穿刺时可能由于血样污染导致假阳性，所以 NTD 产前诊断迫切需要能区分突触型和红细胞型 AChE 的试剂。AChE的检测是神经管缺损的最特异性指标。2（4）绒毛膜 AChE 检测；（5）其他辅助诊断的方法：人绒毛膜促性激素 亚基、游离雌三醇、妊娠相关血浆蛋白的检测。2）各种方法的优缺点和比较（1）甲胎蛋白的检测母血及羊水甲胎蛋白（AFP）检查法：孕妇血清 AFP 是由胎儿肝脏产生的一种特殊蛋白， 胎血中浓度较高。在正常情况下，可通过胎儿尿液及胎儿上皮组织(如呼吸
3、道上皮)进入羊水循环，至孕1218 周，羊水中 AFP 浓度逐渐升高达峰值，而后呈曲线下降，至妊娠晚期达很低水平。当发生 NTDs 时，胎儿的某些部位缺乏正常组织覆盖，导致大量 AFP 渗漏至羊水使其在羊水中的浓度明显升高，并进入母体循环。约 90%的无脑儿，78%88%的开放性脊柱裂胎儿的母血中 AFP 升高，孕中期母血 AFP2.5mmol/L 被定为 NTDs 阳性。测定羊水 AFP 诊断 NTDs 时，亦可由于羊水被胎血污染、孕期计算错误及胎儿患有脐膨出等其他少见畸形而出现假阳性结果。测定孕妇血 AFP 浓度来筛选 NTDs，敏感性可达 80%90%。一般在妊娠 1523 周进行，在此
4、期间，血 AFP 浓度随孕期增加而增加。所以用这一生化指标来筛选 NTDs 时，孕期计算一定要准确。另外，多胎妊娠和一些少见的先天畸形(如胎儿脐膨出等)，也可导致 AFP浓度升高。但由于这一方法的敏感性高，简单易行，无副作用，因而目前被认为是产前筛选开放性 NTDs 的有效方法。但是由于孕妇血AFP 存在一定的假阳性，容易被错判为 NTDs。3（2）B 超检查B 超检查对 NTDs 有较高的准确性， 一般认为妊娠 1618 周开始即可对 NTDs 进行详细的超声诊断，B 超诊断无脑儿可早到孕 12周13 周。无脑儿大部分可通过 B 超检出，显示胎儿颅骨穹隆缺如，结合 AFP 测定有所增高作出诊
5、断。而诊断开放性脊柱裂则较难，主要发现软组织和骨特征。脑膨出检查时发现颅骨突出团块，最有价值的诊断依据是辨认颅骨缺陷。随着高分辨超声诊断仪的不断改进，诊断的准确性大为提高，然而即使是有经验的超声诊断者，仍有约15%的 NTDs 不能被检出。（3）羊水乙酰胆碱酯酶活性检测正常羊水中的胆碱酯酶主要为丁酰胆碱酯酶，而且其活性(5-70U/L)远低于成人血清(1000U/L)，正常羊水中不含乙酰胆碱酯酶（AChE）活性。神经管缺陷胎儿的羊水 AChE 明显升高，约为正常羊水的 3-4 倍。同时测定羊水 AChE 和 AFP 对神经管缺陷诊断的准确率达 994。羊水 AChE 活性测定是产前诊断神经管缺
6、陷的首选指标。脐疝(75)、流产(47)和其他先天性畸形有关的妊娠，AChE 也增高可出现假阳性结果。此外，羊膜穿刺时也可能由于血样污染导致假阳性。（4） 羊水乙酰胆碱酯酶免疫学检测为了 NTD 产前诊断能区分突触型和红细胞型 AChE，用抗人突触型 AChE 多克隆或单克隆抗体检测羊水中异常存在的突触型 AChE，4可以提高诊断的特异性，避免因羊膜穿刺时可能的血样污染而出现的假阳性。（5） 其他血清人绒毛膜促性激素 亚基(-HCG)、游离雌三醇(E3)、妊娠相关血浆蛋白(PAPPA)检测：一般认为人绒毛膜促性激素 亚基(-HCG)、游离雌三醇(E3)主要在孕中期有筛查意义，血E30.7mmo
7、l/L 为异常，妊娠相关血浆蛋白(PAPP-A)在妊娠早、中期均明显降低，因此这些血清标记物可在妊娠中期辅助 AFP 的检查，作为筛查胎儿 NTDs 异常的主要指标，亦可对胎儿染色体异常进行筛选。但血清标记物并不是一项直接诊断 NTDs 的依据。（6）突触型 AChE 寡配体检测法本项目发明了能区分突触型与红细胞型 AChE 及丁酰胆碱酯酶的寡配体，并将之应用于神经管缺损的诊断。三、三、 本发明的目的本发明的目的针对胎儿神经管缺陷症市售诊断试剂的缺点及临床早期诊断的需要，本发明推出拥有自主知识产权的新型寡配体试剂盒。用于严格区分神经型与红细胞型 AChE 及丁酰胆碱酯酶，作为 NTD 产前检查
8、及实验室研究之工具。四、四、 此项目的优势和原创性此项目的优势和原创性本项目所发明的突触型 AChE 寡核苷酸寡配体特异性地与人源突触型 AChE 结合，而不与人源红细胞型 AChE 及人源丁酰胆碱酯酶结合，完全避免了穿刺获取羊水时可能造成的血液污染的干扰，避免5了由此产生的假阳性结果的出现，提高了 NTDs 的确诊率。（1）抗人源性突触型 AChE 的特异性脱氧核苷酸寡配体（简称寡配体）用于突触型 AChE 特异性鉴别的构思新颖，有原创性。（2）此寡配体特异性地与人源性突触型 AChE 反应，而不与人源性红细胞型及人源性丁酰胆碱酯酶反应，为国内外独创。（3）此寡配体可大量合成、易于生产、纯度
9、高、成本低、稳定性好、可常温下运输、长期保存。（4）根据实验需要还可连接巯基、氨基、荧光素、酶等功能基因，扩大延伸其用途。五、国内外研究状况五、国内外研究状况目前还未见到能有效区分神经型和红细胞膜型 AChE 的特异性试剂盒上市。六、实验研究六、实验研究 1、免疫印迹（western blotting）将人脑匀浆、纯化的人红细胞 AChE 及人全血样品进行 SDS-PAGE，转膜后与生物素化寡配体孵育，然后用链亲和素标记的 HRP显色。实验结果显示，寡配体与人脑 AChE 特异性地结合，在 66 kD处呈现一条带（ 图 1 泳道 B），而与纯化人红细胞 AChE（图 1 泳道A）及人全血（图
10、1 泳道 C）无结合。说明寡配体可区分的人突触型AChE 和人红细胞型 AChE。6图 1 寡核苷酸适配体的免疫共沉淀。 A) 纯化人红细胞 AChE; B) 人脑匀浆；C) 人全血；D)纯化的人脑 AChE2、点杂交将胆碱酯酶点样于 NC 膜上，封闭后，然后加入生物素化单克隆寡配体，再用链亲和素连接的 HRP 显色。结果表明寡核苷酸寡配体和天然及变性的人脑 AChE 和电鳐 AChE 显示特异性结合，而与人及牛红细胞 AChE 及人 BChE 无结合能力（表 1）。表 1. 单克隆寡核苷酸寡配体和不同来源的纯化胆碱酯酶的点杂交来源天然酶变性酶人脑 AChE人红细胞 AChE人 BChE+-+
11、-3、酶蛋白结合测定（ ECA）链亲和素包板，BSA 封闭后，生物素化单克隆寡核苷酸寡配体加入每孔孵育。加稀释的不同种属的 AChE 和底物显色液，在414 nm 波长处测定消光值。ECA 显示针对人脑 AChE 的寡配体与人脑 AChE 显示明显的特异性结合反应，而与人红细胞 AChE 及人 BChE 无结合现象（图2）。进一步说明了寡 配体对人突触 AChE 的特异性。7图 2. 寡配体和不同来源的纯化的胆碱酯酶的酶蛋白结合测定。()，人脑 AChE; ()， 人红细胞 AChE; ()， 人 BChE. n = 3， Mean SD.4、试剂盒组份和操作步骤1）组份a) 96 微孔板b)
12、 乙酰胆碱酯酶多克隆抗体c) 羊抗兔酶标二抗d) 阳性对照e) 阴性对照血清f) 浓缩洗涤液g) 底物 Ah) 底物 Bi) 终止液j) 自封袋2）操作步骤：（1）编号：将微孔条固定于支架，按序编号。（2）加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各 50ul 或待测血清样品 50ul 于相应孔中。0.00.20.40.60.81.00.00.20.40.60.81.01.2A414 nmAChE (U/well)8（3）加抗体：分别在每孔中加入乙酰胆碱酯酶多克隆抗体 50ul，轻拍混匀。（4）温育：置 37温育 60 分钟，室温平衡 5 分钟。（5）洗涤：充分洗涤 5 次。（6）加二抗
13、：分别在每孔中加入羊抗兔酶标二抗 50ul，轻拍混匀。（7）温育：置 37温育 60 分钟，室温平衡 5 分钟。（8）洗涤：充分洗涤 5 次。（9）显色：每孔加入底物 A、B 各 50ul，轻拍混匀，置37暗置 15 分钟。（10）终止：每孔加终止液 50ul，混匀。（11）测定：酶联仪 414nm 测定各孔 OD 值。六、六、知识产权情况知识产权情况本项目为拥有自主知识产权的新型 NTD 诊断试剂。已申请中国专利（200310103048.7） 。七、七、市场价值和前景市场价值和前景1、中国出生缺陷监测网报道，1996 年 1 月至 2000 年 12 月，5年期间我国围产儿神经管缺损症流行病学资料如下：发生率（每万人）畸形儿数无脑儿508450脊柱裂6310547脑膨出162704总发生率12921701注：我国婴儿年出生数 1690 万人9世界婴儿年出生数 1.3 亿人2、生命科学实验室的常用生化试剂，国内外有一定需求量。从以上分析，可以看出寡配体试剂盒有广阔市场和巨大经济效益和社会效益。本试剂盒成本低廉、工艺成熟、易于批量生产，如能尽快投入生产并加强营销运作，有可能在短时间内取得收益。九、投资意向九、投资意向专利使用权转让费 100 万元。转让方负责全程技术指导。十、联系方式十、联系方式李前 01066874609 ，13051806097
