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1、A I I 在高糖诱孚太鼠坷I 小球系膜细胞M M P s m R N A 表达中的作用中文摘要A l l 在高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞l V I l V l P sm R N A 表达中的作用中山大学尉属第二医院内分泌科硕士研究生：李海燕导师：丁鹤林副教授摘要糖尿病肾病( d i a b e t i cn e p h r o p a t h y ，D N ) 是糖尿病主要的微血管并发症之一，是l 型糖尿病患者的首要致死、致残原因，在2 型糖尿病患者中，其致死、致残率仅次于大血管并发症。D N 的基本病理改变是细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i
2、x ，E C M ) 积聚和肾小球一肾小管基底膜增厚，最终发展为肾小球硬化及肾小管间质纤维化。I 临床上早期表现为微量蛋白尿，以后发展为临床蛋白尿，最后出现肾功能衰竭。D N 的病因和发病机理至今尚未完全阐明。肾小球系膜区扩张可能是肾功能减退的重要原因，因为系膜区扩张会压追肾小球毛细血管，引起血管腔狭窄和有效滤过面积减少。因此，有必要对系膜区扩张的机理做迸一步研究，为防治D N 提供新的理论依据。E C M 成分处于不断合成和降解的动态平衡中，合成增加和或降解减少均会引起E C M 积聚和系膜区扩张。体内外研究均证实，糖尿病或高糖环境下系膜细胞合成基质成分增加，包括I v 型胶原、纤维连接蛋白
3、( f i b r o n e c t i n ，F N ) 和层粘连蛋白( 1 a m i n i n ，L N ) 等，提示基质合成异常旺盛是引起D N 基质积聚的重要原因。近年来的研究又发现基质降解减少在系膜基质积聚中也起着重要作用。研究者们将系膜细胞培养于放射性标记的基质表面，通过检测培养液中放射性的含量单独研究高糖环境对基质降解的影响，而不受基质合成的干扰。结果发现高糖及糖尿病使系膜细胞的基质降解能力明显下降，而且基质降解受损较合成增加更明显，提示降解受损可能是D N 系膜区基质堆积的重要原因之一。量生! 型塑兰苎璺堡! ! ! 堡墨壁塑竺竺竺! ! 竺型垒查查士竺竺里! 兰塑墨基质
4、金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l L o p r o t e i n a s e s ，M M P s ) 是主要的基质降解酶类，是一组包含2 0 多种酶成员的超家族。根据底物特异性及结构序列相似性，可将M M P s 分为五类：间质胶原酶、明胶酶、基质溶解素、膜型M M P s 和其它。明胶酶有M M P - 2 和M M P 一9 两个成员，能降解基质中大部分I v 型胶原和明胶。M M P - - 9 的降解活性受到基质金属蛋白酶组织抑制物1 ( t i s s m ：i n h i b i t ( ) ro fm e t a l l o p r o t e i n
5、 a s e s 一1 ，T I M P - 1 ) 所抑制。因为I V 型胶原是系膜基质积聚和基底膜增厚的主要成分，与D N 关系最密切，而M M P 9 又是降解I v 型胶原的主要酶，因此研究D N 时M M P - 9 的表达变化具有重要意义。膜型M M P s ( m e m b r a n e , t y p em a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，M T - M M P s ) 是一种比较特殊的M M P s ，其结构上含有跨膜区域，主要参与在细胞膜表面激活M M P - - 2 。目前发现的M T - M M P s 有
6、6 种，在系膜细胞表达的主要有M T l M M P 、M T 2 - M M P 和M T 3 M M P 。目前关于D N时M T - M M P s 表达变化的研究相对较少。目前的研究对糖尿病时M M P s 的表达变化及其机制尚存在矛盾之处。大多数研究证实，糖尿病病人和动物模型肾组织中M M P 9 表达及活性降低，T I M P 1表达及活性增加，高糖培养使正常人、大鼠和小鼠系膜细胞M M P 9 基因和蛋白表达降低，这有助于理解糖尿病时基质降解酶的活性下降，引起基质降解减少和系膜区基质积聚。而亦有研究发现，糖尿病病程4 8 周的非肥胖糖尿病( n o n - , o b e s e
7、 d i a b e t i c ，N O D ) 小鼠的系膜细胞( N O D m e s a n g i a lc e l l ，N O D - M C ) 中，M M P 9 和T I M P I 的活性均较无糖尿病N O D - M C 下降，而高糖培养糖尿病N O D M C 和无糖尿病N O D M C 3 周，对两组细胞M M P - 9 活性均无明显影响。尽管研究结果不一致，但大多数研究显示糖尿病时肾脏表达M M P 9 与T I M P - l 的比值下降，这提示M M P s 和T I M P s 的绝对水平可能并不重要，它们的相对水平才是维持正常基质成分的关键。对M T
8、- M M P s 研究最广泛的是M T l - M M P ，它在激活M M P 2 中起主要作用。有研究显示，高糖培养下调人系膜细胞M T l 一M M P基因和蛋白表达。而高糖对系膜细胞M T 2 M M P 、M T 3 - M M P 表达的影响尚未见研究报道。高血糖状态导致基质积聚的中介因子还没有完全阐明。大量实验及临床研究证实血管紧张素转换酶抑制剂( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e i n h i b i t o r ，A C E I ) 及血管紧张素I I 受体阻断剂( a n g i o t e n s
9、 i nI Ir e c e p t o rb l o c k e r , A R B ) 能减少系膜基质I IA I 在高糖诱导太鼠肾一1 、球系膜细胞M M P s m R N A 表达中的作用中文摘要积聚，减轻蛋白尿，延缓D N 进展，强烈提示血管紧张素I I ( a n g i o t e n s i nI I ，A I I )在D N 发生发展中起重要作用。研究发现A I I 和高糖可引起多种相似的效应，如刺激转化生长因子- B ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - B ，T G F B ) 和纤溶酶原激活物抑制因子1 (
10、 p l a s m i n o g e na c t i v i t o ri n h i b i t o r 一1 ，P A l 1 ) 表达、增加基质蛋白合成及抑制基质降解酶活性等。A I I 引起基质合成增加的研究证据已相当丰富，而近几年的研究也发现A I I 在基质降解受损中亦发挥重要作用。体外注射A I I 引起大鼠肾脏系膜区基质明显堆积：培养液中加入A I I 可导致系膜细胞基质降解减少及胶原酶活性下降；高糖引起的大鼠系膜细胞M M P 2 活性下降及胶原降解减少能被A R B 所逆转：糖尿病大鼠肾组织中M M P 一9 活性下降，T I M P 1 表达增加伴胶原堆积，A C
11、E I 治疗能部分逆转这些变化。这些研究提示A l l 能引起基质降解减少，并可能参与介导高糖对基质降解的抑制效应。M M P s 是肾脏降解基质的主要酶类，因此，进一步研究A I I 对M M P s 表达的影响有助于阐明基质降解受损的机制。由于A I I 具有明显的血流动力学效应，且体内存在复杂的调控因素，A I I 在D N 中发挥作用的机制还不是很清楚。体外培养的系膜细胞含有R A S 成分，可作为研究A I I 非血流动力学效应的良好模型。高糖及A I I 引起M M P s 表达变化的机制尚不很清楚。它们可能通过增加T G F D 表达，结合于T G F B 抑制元件( T G F
12、 Bi n h i b i t o r ye l e m e n t ，T I E ) 而抑制M M P s基因表达，或通过激活活化蛋白1 ( a c t i v a t o rp r o t e i n ，A P - 1 ) 、核因子KB ( n u c l e a rf a c t o r - KB ，N F KB ) 等转录因子而启动M M P s 基因转录。而且，高糖及A I I 可刺激P A l 1 表达，抑制纤溶酶原激活物的活性，减少纤溶酶生成，从而抑制M M P s酶原活化。根据以上研究背景，我们提出这样几个问题：A I I 是否为高糖发挥效应的中介因子? 高糖对系膜细胞M M
13、P s 表达的影响是否由A I I 介导? A C E I 及A R B 是否通过影响M M P s 表达及活性而延缓D N 进展? 这些正是本实验试图探讨的问题。研究目的1 观察高糖及A I I 干预下大鼠系膜细胞M M P 一9 、T I M P l m R N A 表达变化和I I I兰堕塑堡兰查璺堡：! ：堡墨竖塑些坚竺! ! 唑! 垒查竺主竺竺里圭塑兰M M P 一9 T I M P l m R N A 比值变化，以及M T I M M P 、M T 2 M M P 、M T 3 M M P m R N A表达变化。2 研究A I I 在高糖诱导大鼠系膜细胞M M P 一9 、T I
14、 M P 1 m R N A 表达变化和M M P - 9 T I M P 一1 m R N A 比值变化，以及M T l M M P 、M T 2 一M M P 、M T 3 一M M P m R N A表达变化中的作用。研究方法1 大鼠肾小球系膜细胞的分离和培养取健康雄性S D 大鼠2 只，体重约1 5 0 9 。麻醉大鼠后，无菌条件下取出双肾，剥除肾包膜，分离出肾皮质，剪碎后，置于1 5 0 、8 0 、2 0 0 目重叠的筛网上，用消毒玻璃注射器针芯在最上层筛网轻碾肾皮质碎块，用P B S 间断冲洗，最后在2 0 0 目筛网上收集肾小球。经0 1 I V 型胶原酶消化后，用完全R P
15、M I l 6 4 0 培养液( 含2 0 F C S 、5 “g m l 胰岛素、1 0 0 U m l 青霉素、1 0 0l ag m l 链霉素、1 5 m m o l LH E P E S 、3 0 m g m l 谷氨酰胺) 悬浮肾小球，接种于培养瓶，置于C 0 2 恒温培养箱( 3 7 ，5 C 0 2 ) 孵育。第6 天首次换液，以后每2 3 天换液次。培养约4周，细胞接近融合时进行消化传代。经鉴定为系膜细胞后，取3 6 代用于实验。2 大鼠肾小球系膜细胞的鉴定综合相差显微镜和透射电镜下形态学、肌动蛋白免疫细胞化学染色和对A I I刺激的反应进行鉴定。3 实验分组( s a r
16、a l a s i n 为A I I 竞争性受体拮抗剂，以下简写为S )( 1 ) N G ( 含5 6 m m o l L 葡萄糖)( 2 ) H G ( 含3 0 m m o l L 葡萄糖)( 3 ) N G + A I I ( 10 6 m o l L )( 4 ) N G + A I I ( 1 0 6 m o l L ) + s a r a l a s i n ( 1 0 4 m o l L )( 5 ) H G + s a r a l a s i n ( 1 0 4 m o l L )每组6 个复孔，五组培养液干预细胞2 4 小时后，检测各指标。I VA I I 在高糖诱导大鼠矛小球系膜细胞M M P s m R N A 袁迭中的作用中交摘要4 系膜细胞产生A l l 水平的测定N G 组、H G 组和H G + S 组培养液干预细胞2 4 小时后，留取培养上清，用放射免疫分析法( A ) 检测A I I 含量。5
