基因组编辑技术

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1、16/4/18 1 基因组编辑技术 基因组编辑技术 Gene editing tools ZFN TALEN Case9 RNA-guidedendonuclease Nature杂志介绍了2014年值得关注的技术Nature杂志介绍了2014年值得关注的技术, ,包括包括 CRISPR和基因组编辑 CRISPR和基因组编辑 20112011 Nature年度技术Nature年度技术：人工核酸酶介导的基因组人工核酸酶介导的基因组 编辑（genome编辑（genome editingediting withwith engineeredengineered nucleasesnucleases）

2、技术 技术 基因组编辑技术基因组编辑技术：又称为基因组定点修饰技术又称为基因组定点修饰技术，原则原则 上能在任何物种基因组的任何位置上进行定点切除上能在任何物种基因组的任何位置上进行定点切除，从而能从而能 在内源性序列上产生突变在内源性序列上产生突变。 人工核酸酶人工核酸酶 锌指核酸酶锌指核酸酶 （ZFN（ZFN） 转录激活因子样效应物核酸酶转录激活因子样效应物核酸酶 （transcription（transcription activator-likeactivator-like effectoreffector ucleasesucleases，TALENsTALENs） 单链RNA介导的

3、CRISPR-Cas9 单链RNA介导的CRISPR-Cas9 归巢核酸内切酶归巢核酸内切酶（engineered （engineered meganucleasesmeganucleases） 锌指核酸酶（ZFN）锌指核酸酶（ZFN）：zinczinc fingerfinger nucleasenuclease，又又 名锌指蛋白核酸酶名锌指蛋白核酸酶，是一种人工改造的核酸内切是一种人工改造的核酸内切 酶酶，由一个由一个 DNADNA 识别域和一个非特异性核酸内切识别域和一个非特异性核酸内切 酶构成酶构成，其中DNA识别域赋予特异性其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定在DNA特定 位点结合

4、位点结合，而非特异性核酸内切酶赋予剪切功能而非特异性核酸内切酶赋予剪切功能， 两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。 归巢核酸内切酶（engineered归巢核酸内切酶（engineered meganuclease）meganuclease）: : 又称大范围核酸酶”又称大范围核酸酶”，是一种切割得非常罕见的是一种切割得非常罕见的 核酸内切酶核酸内切酶。它们可以识别的DNA序列要比“经它们可以识别的DNA序列要比“经 典典”限制酶可以识别的大得多限制酶可以识别的大得多，所以它们在人类所以它们在人类 基因组中产生解离的频率低基因组中产生解离的频率低。

5、这使得它们有可能这使得它们有可能 用于基因疗法用于基因疗法，作为具有高度针对性的分子刀来作为具有高度针对性的分子刀来 瞄准特定的基因瞄准特定的基因。 转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)：TALEs首TALEs首 先是在植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas先是在植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas) )上发现上发现 的的，特异性地结合DNA特异性地结合DNA，在该病原菌感染过程中对在该病原菌感染过程中对 植物基因进行调控植物基因进行调控。一个TALE上用于序列特异性一个TALE上用于序列特异性 识别的DNA结合结构域融合到一个在DNA序列

6、产生识别的DNA结合结构域融合到一个在DNA序列产生 双链断裂(double双链断裂(double strandstrand break,break, DSBDSB) )的内切核的内切核 酸酶(酸酶(FokIFokI) )的催化性结构域的催化性结构域，便产生了TALEN便产生了TALEN。 单链RNA介导的CRISPR-Cas9 单链RNA介导的CRISPR-Cas9 FokI 是一种存在于细菌是一种存在于细菌FlavobacteriumFlavobacterium OkeanokoitesOkeanokoites 的的typeIIstypeIIs 限制酶限制酶， 分子量为65分子量为65.

7、.4KDA4KDA，含584个氨基酸含584个氨基酸， 包含有位于N端的DNA结合区域包含有位于N端的DNA结合区域，以以 及一个位于C端的非专一性DNA切割及一个位于C端的非专一性DNA切割 区块区块。当此酶与DNA识别域结合后当此酶与DNA识别域结合后， 会把位于结合位置下游的9-13个核会把位于结合位置下游的9-13个核 苷酸切除（不需特定序列）苷酸切除（不需特定序列）。 该酶的催化活性必须要在DNA序列上该酶的催化活性必须要在DNA序列上 形成相互靠近的二聚体后才能发挥形成相互靠近的二聚体后才能发挥 内切酶的作用内切酶的作用，因此因此，构建的人工构建的人工 核糖核酸酶大多是由一对分别识

8、别核糖核酸酶大多是由一对分别识别 把位点两侧DNA序列的蛋白组成把位点两侧DNA序列的蛋白组成。 5 5-GGATG-3 -GGATG-3 3 3-CCTAC-5 -CCTAC-5 16/4/18 2 ZFNZFN的发现 的发现 最早的ZFN最早的ZFN 出现在17年前出现在17年前。JohnsJohns Hopkins大学的ChandraHopkins大学的Chandra 把锌指(zinc把锌指(zinc finger,finger, ZF)ZF) 结构域与IIs型限制性核酸内切结构域与IIs型限制性核酸内切 酶FokI的切割域融合, 酶FokI的切割域融合, 获得了具有新识别特性的核酸内切

9、获得了具有新识别特性的核酸内切 酶(Kim等1996)酶(Kim等1996)。 不久,不久, CarrollCarroll 与Chandra合作, 与Chandra合作, 在爪蟾(在爪蟾( XenopusXenopus laevis )laevis ) 卵母细胞开展了ZFN卵母细胞开展了ZFN 介导的外源DNA修复实验, 介导的外源DNA修复实验, 并取得了成功(Bibikova等2001)并取得了成功(Bibikova等2001)。 2002年,2002年, CarrollCarroll 又用ZFN又用ZFN 敲除了果蝇(敲除了果蝇( DrosophilaDrosophila melanog

10、astermelanogaster) )的一个内源基因(Bibikova等2002)的一个内源基因(Bibikova等2002)。 这两个实验标志着用ZFN这两个实验标志着用ZFN 定点修饰真核生物基因组的开端 定点修饰真核生物基因组的开端 ZFNZFN工作原理 工作原理 (Miller, J.C. et al ., 2007) (Gabriel， R.et al., 2011) ZFN技术的临床运用 ZFN技术的临床运用 传统的基因治疗的方式主要有两种传统的基因治疗的方式主要有两种，一种是利用病毒携一种是利用病毒携 带完整的基因序列送入人体内或者是注入一小段正确的带完整的基因序列送入人体内或

11、者是注入一小段正确的 DNA序列来修正错误然DNA序列来修正错误然，而到安全性无法保证而到安全性无法保证。 发展基因治疗上最基本的原则是同源重组发展基因治疗上最基本的原则是同源重组。包括两个步包括两个步 骤骤：首先在DNA中引入一个双链断裂首先在DNA中引入一个双链断裂，启动细胞自身的修启动细胞自身的修 复系统复系统；之后“同源重组之后“同源重组”参考引入的相似序列作为模参考引入的相似序列作为模 板修复这段基因板修复这段基因，从而实现指定部位的碱基替换从而实现指定部位的碱基替换。 2005年2005年，Urnov等针对一个IL2R基因上的突变而引起严重Urnov等针对一个IL2R基因上的突变而

12、引起严重 的免疫不全症的免疫不全症，针对此疾病设计了四指的ZFN针对此疾病设计了四指的ZFN，利用该系利用该系 统介导了人类细胞IL2R的高效修复统介导了人类细胞IL2R的高效修复。在无选择压力下修在无选择压力下修 复效率达15%18%复效率达15%18%，这样的修复效率已足够用于基因治疗这样的修复效率已足够用于基因治疗。 ZFN技术的不足 ZFN技术的不足 寡核苷酸链的长度大约为15-16个核苷酸时可以保证识别的特异性寡核苷酸链的长度大约为15-16个核苷酸时可以保证识别的特异性。一个锌指结构域只能识别3bp一个锌指结构域只能识别3bp，而如果用锌指基序作用识别的基本单而如果用锌指基序作用识

13、别的基本单位的话位的话，大约需要5-6个锌指串联大约需要5-6个锌指串联，操作繁琐操作繁琐。 ZFN剪切的准确性不强ZFN剪切的准确性不强：DNA的剪切需要两个FokI切割区域的二聚化DNA的剪切需要两个FokI切割区域的二聚化。因为二聚化的过程是独立于DNA剪切的因为二聚化的过程是独立于DNA剪切的，两种单元所形成的同源二聚两种单元所形成的同源二聚体同样可以造成DNA的剪切体同样可以造成DNA的剪切，这些ZFN会切割基因组中的假回文序列这些ZFN会切割基因组中的假回文序列。这些非特异性行为可能带来ZFN毒性这些非特异性行为可能带来ZFN毒性。 在临床治疗上在临床治疗上，人们不能预期引入的ZF

14、N蛋白是不是会引起免疫系统人们不能预期引入的ZFN蛋白是不是会引起免疫系统的进攻的进攻。 锌指核酸酶技术从一开始就被Sangamo生物公司所垄断锌指核酸酶技术从一开始就被Sangamo生物公司所垄断，该公司只与该公司只与部分科研机构合作部分科研机构合作，它与大规模的临床应用甚至是实验室研究尚有很它与大规模的临床应用甚至是实验室研究尚有很大距离大距离。 转录激活子样效应因子转录激活子样效应因子 ( (TranscriptionTranscription Activator-likeActivator-like EffectorsEffectors) ) Xanthomonas(黄单胞菌） 三型分

15、泌系统 (Type secretion system, T3SS) TALE TALEN的发展 TALEN的发展 1989年1989年，人们发现了TALE蛋白家族的第一个成员人们发现了TALE蛋白家族的第一个成员 AvrBs3AvrBs3。 2009年2009年，揭示了TALE揭示了TALE蛋白特异结合宿主基因启动蛋白特异结合宿主基因启动 子的机制子的机制。 TALE的结构 16/4/18 3 2011年2011年，首次把TALE与FokI结合在一起组成TALEN首次把TALE与FokI结合在一起组成TALEN，并证实TALEN起到分子剪刀的作用并证实TALEN起到分子剪刀的作用。 2012年2012年，清华大学施一公带领的团队通过解析清华大学施一公带领的团队通过解析TALE蛋白的晶体结构TALE蛋白的晶体结构，清晰地揭示了TALE蛋白特清晰地揭示了TALE蛋白特异识别DNA的机理异识别DNA的机理。 TALEN的发展 TALEN的发展 NaturalNatural structurestructure ofof TALEsTALEs derivedderived from from Xa