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1、 论著干扰素- 2b对宫颈癌细胞HPV16 E6E7 基因抑制作用的研究赵超 魏丽惠【摘 要】 目的 研究干扰素- 2b对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用,从细胞生物学及分子生物学水平探讨干扰素- 2b对宫颈癌细胞SiHa的作用机制。应用RT - PCR半定量检测细胞内HPV16 E6E7 mRNA表达,观察干扰素- 2b对宫颈癌SiHa细胞中HPV16 E6E7 mRNA表达的影响。方法 以不同浓度的人重组干扰素- 2b含药培养液作用于感染HPV16的人宫颈癌细胞系 SiHa细胞,并设立无药对照,通过MTT及流式细胞分析技术检测该药对细胞生长及增殖的影响;进行细胞凋亡检测并用RT - PCR
2、法半定量检测对HPV16 E6E7基因表达的影响。结果 经含有干扰素- 2b的培养液作用后,细胞数量减少, 1 000 IU/ ml的干扰素- 2b对细胞抑制作用最强;细胞周期各时相中, S期细胞所占比例明显减少;均可诱导细胞凋亡;均使细胞中HPV16E6E7 mRNA表达明显减少。结论 干扰素- 2b不仅可直接抑制宫颈癌细胞的生长,并可能通过抑制HPV16E6E7基因表达的分子机制,达到抑制肿瘤目的。【关键词】 干扰素;宫颈癌;人乳头状瘤病毒Inhibition of interferon- 2b on HPV16 E6E7 in cervical carcinoma cellsZHAO C
3、hao , WEI Lihui.(Department of Obstetrics and Gynecology ,Peking University Peoples Hospital ,Beijing 100044 ,China)【Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of Interferon- 2b , as an inhibitor for cervicalcarcinoma cell growth. Methods The human cervical carcinoma cell line -SiHa
4、was incubated with different concentra2tions of Interferon- 2b , and cell growth and proliferation were measured by MTT assay , flow cytometry (FCM) andAnnexin V - FITC apoptosis assays.The expressions of HPV16 E6E7 genes were simultaneously detected by reversetranscription - polymerase chain reacti
5、on (RT -PCR) .Results After incubated with Interferon- 2b , the cells growthslowed down.The viabilityof the cancer cellsfell down with less cells at the Sphase and apoptosis was induced significantly. Atmolecular level , the mRNA expressions of HPV16 E6E7 were decreased. Conclusions Interferon- 2b c
6、an suppress the cer2vical carcinoma cell directly and restrain the tumor by inhibition of the expression of HPV16 E6E7 genes.【Key words】 Interferon; cervical carcinoma ; human papillomavirusChin J Clin Obstet Gynecol , 2005 , 6 : 192 - 195近年来的药理研究及临床应用表明,干扰素 具有抗肿瘤、增强免疫及抗病毒等作用。临床实验 证明,以干扰素局部用药对宫颈糜烂及宫
7、颈癌有 一定的疗效。因此,有必要从细胞及分子水平阐明其抑制病毒复制及肿瘤生长的作用机制。材料与方法一、实验材料本课题受北京市自然科学基金(87022020)、北京大学211工 程肿瘤学科群资助 作者单位: 100044 北京大学人民医院妇科11 实验药物:选用重组人干扰素- 2b (安徽 安科生物工程股份有限公司生产的安达芬水针)100万IU/支,以DMEM全培养液稀释至稀释比 例为110 000、11 000、1100的所需浓度,其中所含重组人干扰素- 2b浓度分别为100 IU/ ml、1 000 IU/ ml、10 000 IU/ ml。21 人宫颈癌细胞系 SiHa细胞(HPV16 E
8、6、E7均为阳性)购自美国ATCC细胞库,并保存于 本研究室。31 试剂: DMEM全培养液(购自美国GIBCO291中国妇产科临床杂志2005年5月 第6卷 第3期 Chin J Clin Obstet Gynecol May 2005 , Vol16 , No13 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.公司) ;胎牛血清(购自Hyclone公司)青霉素和 链霉素购自华北制药厂。FITC - AnnexinV/ PI检测凋亡试剂盒为北京宝赛生物技术有限公司产品。Trizol试剂盒等所用试剂
9、均购于GIBCO公司。 二、实验方法11 细胞培养:选用人宫颈癌细胞系 SiHa细 胞(HPV16 E6、E7均为阳性)于DMEM含胎牛血清浓度为10 % ,青霉素100 IU/ ml ,链霉素100 g/ ml的全培养基中培养,其中,在恒温培养箱中以5 % CO2、37 及饱和湿度条件下培养,每23d换液一次,当细胞80 %融合时传代。21MTT检测:取进入对数生长期的细胞,0125 %胰酶消化,制成单细胞悬液,计数。调整细 胞浓度为315105个细胞/ ml ,接种于96孔培养 板中,每孔011 ml (细胞数为315104个细胞/ 孔) , 37, 5 % CO2培养箱孵育过夜后,分别加
10、 入已稀释比例为110 000、11 000、1100三种含药培养液,每种浓度设立5个平行对照,并设正常 对照及空白对照,置正常培养条件下培养。每48 h 换液一次。含药培养液作用24 h后,每孔加入5mg/ ml的MTT溶液20l ,继续培养4 h ,吸弃孔 内培养液,每孔加入DMSO 100l ,振荡摇匀,室温静置2030 min后选择490 nm ,在酶联免疫检 测仪(Bio - Rad公司生产)上测定各孔吸光度 (OD)值,以后每隔24 h检测1次,共5次。31 流式细胞仪检测细胞生长周期的变化:分别 收集以不同浓度的含药培养液作用72 h及对照组细胞, 80 %冷乙醇固定, 4 过夜
11、, PBS冲洗去除固定 液,加入10 mg/ ml的Rnase A溶液5l混匀, 37 孵育30 min ,加入PI染液至终浓度25g/ ml ,混 匀,常温避光染色30 min后,以FACSort流式细胞 仪(Becton Dickinson公司生产)进行荧光检测,ModFit LT软件分析细胞周期各时相的特点。41 细胞凋亡检测:将不同浓度的含药培养液 作用72 h细胞及对照组细胞分别经PBS冲洗3遍 后,加入0125 %胰酶消化并收集至离心管中。按 照Annexin V - FITC凋亡检测试剂盒说明书操作, 具体如下: 0125 %胰酶消化细胞,调整待测细胞浓度为5105/ ml。取1
12、 ml细胞, 4, 1 000 rpm/min ,离心10 min ,弃上清。加入1 ml冷的PBS,轻 轻振荡使细胞悬浮。4, 1 000 rpm/ min ,离心10min ,弃上清。重复洗细胞两次后,将细胞重悬于200l Binding Buffer。加入10l Annexin V - FITC和5l PI (碘化丙啶)混匀。加入300l BindingBuffer ,在1 h内应用FACSort流式细胞仪检测。51RT - PCR方法半定量研究HPV16 E6E7表 达的改变:取进入对数生长期的细胞,以不同浓度 的含药培养液作用72 h后,以Trizol试剂盒提取细 胞中的总RNA ,
13、经M - MLV逆转录酶反应体系逆 转录为cDNA , HPV16 E6E7及内参GAPDH PCR引 物序列如下1,由上海博亚生物技术公司合成:HPV16 E6E7的引物序列(扩增片段长度616 bp) : 上游5- TGACTTTGCTTTTCGGGATT - 3 、下游5- GAGAACAGATGGGGCACAC - 3;内参GAPDH 的引物序列(扩增片段长度307 bp) :上游5- CG2GAGTCAACGGATTTGGTCGT AT- 3 、下 游5-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC - 3 。扩 增 条 件: 92 预变性5 min; 95 变性1 min ,
14、60 退火1min , 72 延伸1 min ,共35个循环; 72 后延伸10min。以单纯加入内参引物扩增作为阴性对照。每一PCR反应至少重复3次。PCR产物分析:扩增产物 于2 %琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并照相,密 度扫描分析仪测定吸光度(IOD)值。 三、统计学分析采用单因素方差分析。结果一、对细胞生长及增殖的影响11MTT法检测各孔吸光度(OD)值:用药后 各组与对照组相比,可见出现了活细胞数量减少, 吸光度值均较对照组降低,随药物浓度增高,吸光 度值有降低趋势(P0105) ,但可以看到1 000 u/ ml的干扰素- 2b对 细胞抑制作用最强。(见表1)表1 MTT法吸光度检
15、测结果(OD值) (?xs,n= 5)时间 对照 100 IU/ ml 1 000 IU/ ml 10 000 IU/ ml24 h01272 801023 401269 001021 101224 301028 0301262 401019 448 h01383 501030 901335 701037 3301281 301022 0301344 301015 73 72 h01416 201037 601394 301050 201284 801024 3301361 801024 53 96 h01496 201047 601446 801049 3301336 301019 4301
16、371 301021 23 120 h01529 701055 501450 201033 8301358 701032 6301397 801038 43注:3 与对照组相比,P 010521 流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化: 实验组S期所占比例较对照组减少,其差异有显著 性(P 0105) ,见表2。391中国妇产科临床杂志2005年5月 第6卷 第3期 Chin J Clin Obstet Gynecol May 2005 , Vol16 , No13 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表2 细胞周期各时相比例变化(?xs,n= 5)细胞周期对照100 IU/ ml1 000 IU/ ml10 000 IU/ mlS期( %
