《血管平滑肌细胞原代培养经验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血管平滑肌细胞原代培养经验（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、兔血管平滑肌细胞原代培养我是某医学院的硕士研究生，课题涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养，实验开始非常不顺利，进行了几次实验均一无所获。后来我在丁香园上发帖提问（http:/ 培养基的配制：在新购进的500ml DMEM/F12 培养基内加入 5ml 双抗及适当比例的 FBS(原代20%，3代后5%)，配制成完全培养基，4保存备用。兔SVMCs 的原代培养：体重2kg3kg 的雄性日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死后，置于操作台。从腹部切开，分离腹部血管，暴露腹主动脉，无菌条件下切下约 5cm 长的动脉，装入含双抗的PBS 中备用。在超净台内将取材的血管在DMEM 中漂洗数次，小心将外膜剥去
2、，用双抗浸泡数分钟后，直接加入胰酶，在胰酶双抗混合液中用眼科剪将组织块剪碎，将双抗和胰酶混合后用1ml 移液枪吸去，加入3ml培养基,用吸管吹打后将组织块和培养液吸入25cm2细胞培养瓶中，直接用移液器将液体大部分吸出，盖紧瓶口后瓶口向上竖立放入培养箱，约 1.5h 后加入DMEM/F12 培养基(含20%FBS, 1%双抗)，每个培养瓶约2.0ml，缓慢将瓶身翻转，使培养基覆盖组织块，将瓶口拧松，放入 CO2养箱，静置3d4d 观察。这是手术中的图片，上面灰白的那根是腹主动脉。这是超净台里剥开了一半的血管，要的是上面这部分，下面的是血管外膜及筋膜等，丢弃这是剪碎了的组织块，泡胰酶和泡双抗都是
3、这么泡，后期我做的时侯比这个剪得还要碎:这是剪好后放到培养箱里的图片，瓶口向上立着的两瓶是我的。细胞分散(这步也比较重要，一瓶里面几十个组织块，只有几个甚至一个组织块有细胞游出，不分散的话，传代细胞很少，养不活，不传代的话细胞老在一个地方长，挤得要命，也难养活的）：原代组织块一般5d7d 有细胞游出，当游出的细胞在部分组织块周围密集成层后即可进行细胞分散。弃原培养基，0.25%胰酶-EDTA 1ml 消化细胞，40s后弃大部份胰酶，继续在显微镜下观察消化情况并拍打培养瓶，当有细胞浮起游动时，加入 6mlDMEM/F12 培养基，终止消化。继续晃动培养瓶，观察到细胞大部份浮起，放入培养箱中。3d
4、 换液一次，待细胞长满后按1:3 比例传代或者冻存。(以下几步恕无法提供图片）HE 染色观察兔VSMCs:将生长良好的第3 代细胞消化后接种于放有载玻片并经高压消毒的玻璃平皿中，待4h细胞贴壁后，向玻璃平皿中补足培养液，继续培养。细胞爬满后，取出爬片，用 PBS 冲洗，乙醚酒精固定，用电吹风吹干。进行HE 染色，步骤如下：蒸馏水洗2mins-苏木精染色10mins-自来水洗1min-1%盐酸酒精分化20s-自来水洗1min-稀氨水蓝化1min-70%酒精2mins-伊红染色1min-80%酒精脱水30s-95%酒精 30s-无水酒精I2mins-无水酒精II2mins-无水酒精III2mins
5、-二甲苯 I5mins-二甲苯II5mins。中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。兔VSMCs 的免疫组化鉴定：将生长良好的第3 代细胞消化后接种于放有载玻片并高压消毒的玻璃平皿中，待4h 细胞贴壁后，向玻璃平皿中补足培养液，继续培养。细胞爬满后，取出爬片，用 PBS 冲洗2 次，甩干后加入乙醚酒精，数秒后用吹风机吹干。用 PBS 冲洗3 次，每次冲洗后等待3min，再冲洗下一次。加入曲拉通X-100，等待 10min，再用 PBS 冲洗3 次。加入双氧水，10min，PBS 冲洗3 次后加入一抗。4下过夜。次日早晨取出载玻片，PBS 冲洗 3 次，加入二抗，室温下15min，PBS 冲洗3 次
6、。加入新配的 DAB 显色剂（0.85ml 蒸馏水，再加DAB缓冲液，DAB 底物，DAB 染色液各一滴，混匀），7min 后，用自来水冲洗，复染苏木素（过程：DAB 染色后蒸馏水泡2min-苏木素复染 1.5min-自来水洗30s-盐酸酒精分化 20s-温水返蓝 1min-80%酒精2min-95%酒精2min-无水酒精 I2min-无水酒精II2min-二甲苯I5min-二甲苯 II5min)。然后滴加中性树胶，放上盖玻片，显微镜下观察，拍照。兔VSMCs 的透射电镜观察：取出两瓶生长良好的细胞，PBS 冲洗两次后加入胰酶，消化约 30s后待细胞变圆时弃胰酶，加入5ml 培养基，吹打后将两
7、瓶细胞悬液合并后放入 15ml 离心管，1000rpm离心 5ml后小心弃上清，用移液器缓缓加入固定液约 1ml，送电镜室进行透射电镜观察。相关讨论本实验主要采用组织贴块法，进行了以下改进：1.在将血管中膜组织块剪碎至 1mm3大小后，移入培养瓶前，用0.25%胰酶消化组织块1min，然后用含FBS 的 DMEM培养基终止消化，再将组织块移入培养瓶中。可以使细胞基质的主要物质胶原纤维得以减少，组织块变得疏松，有利于VSMCs 从组织块中游离出，加快了细胞的生长速度，缩短了细胞融合时间。2.组织块移入培养瓶后，文献报道多为将培养瓶翻转，有组织块的培养瓶底面朝上放置 3h4h 后再小心翻转培养瓶，
8、使组织块与培养基接触。在实验中我们发现这样3h4h 后组织块周围仍很潮湿，使其不能很好贴于瓶底，翻瓶后仍有很多组织块漂起。我们在实验中将翻瓶改进为将培养瓶口朝上竖立放入培养箱，利用液体的重力作用使瓶底（尤其是组织块周围）的液体流至瓶底部，这样减少了翻瓶的等待时间，2h 后翻瓶，飘起的组织块很少。这样使组织块能够尽早接触培养液，有利于细胞更早游出。3.采用含 20%FBS 的DMEM 培养基比含10%FBS 的培养基实验更有利于细胞游出。4.当游出的细胞在少数组织块周围爬出较多并已生长分层后，应当及时进行细胞分散，即用胰酶消化至细胞变圆后加入含血清培养基终止消化，使细胞漂浮至培养瓶各处，在培养瓶中均匀分布，减少细胞长满的时间。尽管进行了上述改进，实验结果显示组织贴块法原代培养 VSMCs 的成功率仍很低。本实验一共进行了22 次原代取材，最后统计结果有细胞游出的共有6 次，成功率约27%。其余未见细胞游出的情况中，组织块污染的有 8 次，占36%，还有8 次是长时间（1个月）无细胞游出,占36%。因此污染和无细胞游出是组织贴块法原代培养VSMCs 失败的主要原因。在有细胞游出的6 次中，游出最早的为取材后第6d，最迟的为取材后20d，平均细胞游出时间为11.3d。
