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1、作者简介: 于莉, 女, 1979 年 11 月 出生, 黑龙江人, 硕士, 住院医师。 联系电话: 0451?89232063; E?mail: jasmine791117 163. comAbout YU Li:Female, born in No? vember, 1979. Master degree. Tel: + 86 ?451 ?89232063;E?mail: jasmine 791117 163. com收稿日期: 2007?02 ?01 修回日期: 2007?03 ?27 本文编辑: 周志新 作者单位: 150001 ? 黑龙江省哈 尔滨市, 哈尔滨医科大学附属第 一临床医
2、院眼科医院 通讯作 者: 高 维奇, 联系电 话: 0451?53643849 ?3959 Received date:Feb 1, 2007 Accepted date:M ar 27, 2007 From the Dep artment ofOp h? thalmology , the First A f f iliated H osp ital of H arbin Medical U? niversity , H arbin 150001, H ei? longjiang Province, China Responsible author:GAO Wei?Qi, Tel: + 86
3、?451?53643849 ?3959透明质酸钠联合抗氧化剂中期保存 兔角膜于 ? 莉 ? 高维奇 ? 刘 ? 平 ? 马英娜 ? 崔璟琳 ? 关立南Applic ation o f so dium hy aluro na te a nd a ntio x? ida nt o n m id?te rm c o rne a l pre se rv a tio n YU Li, GAO Wei?Qi, LIU Ping, MA Ying?Na, CUI Jing ?Lin, GUAN Li?Nan ?Keyw ords ?corneal preservation; sodium hyalurona
4、te; glutathione hor? mone; VitC ?Abstract ? Objective ? To study the effect of sodium hyaluronate andantioxidant (GSH and VitC) in mid ?term corneal preservation and provide experimental basis for clinical application.Me thods ? MK medium made by ourselves was the control group.The medium contained
5、sodium hyaluronate and antioxidant at 4 !was ex? perimental group. At the3rd day,the 7th day,the 10th day,the 14th day after pres? ervation, the viability of corneal endothelial cellswere assessed by the corneal mor? phology;The thickness of center cornea, trypan blue ?alizarin red stain, the ultra
6、? structure of comea was observed by electron microscope. Results ? Compared with control group,the cornea of the experimental group had better transparence,less e ? dema,and endothelium cells connected closely under light microscope. There was statistical differences between control group and exper
7、imental group(P 0. 05 0. 001 0. 001 0. 001 0. 0012. 4? 扫描及透射电镜观察? 扫描电镜观察: 实验组 保存 14 d 的角膜内皮细胞六角形镶嵌结构正常, 细 胞连接较为紧密, Y 型连接无断裂, 胞体较大, 部分 细胞核突起明显, 细胞表面有大量微绒毛( 图 5) 而对 照组角膜内皮细胞已大部分凋亡坏死, 胞膜不完整, 胞质裸露( 图 6) 。透射电镜观察: 实验组保存14 d的 角膜内皮细胞, 细胞核成梭形, 核膜下可见高密度染 色质轻度边集现象, 线粒体肿胀, 细胞核的一端有 丰富的细胞器结构。 而对照组角膜内皮细胞已Figure 5?
8、 SEM of the surface of ex periment group cornea ( % 3 500) . T he surface of ex periment g roup corneal epithelium was smooth and the super ficial cells were regular. T he microvillus were thick? 实验组保存 14 d 角膜内皮细胞的扫描电镜图( % 3 500) , 细胞六角形镶嵌结构正常, 表面有大量微绒毛Figure 6? SEM of the surface of control g roup
9、cornea( % 3 500). T he superficial cells were irregular and many cells necrosis? 对 照组保存 14 d 角膜内皮细胞的扫描电镜图( % 3 500) , 角膜内皮 细胞已大部分凋亡坏死大部分凋亡坏死, 线粒体严重肿胀, 胞质内大量空泡 及髓样结构, 细胞核固缩。 2. 5 ? 污染监控 ? 2 组保存液在保存过程中, 液体澄 清, 均未见混浊及絮状沉淀。2 组送检样本, 菌检均 为阴性。3? 讨论角膜的中期保存, 是用活性保存液在 4 ! 保存 条件下, 维持角膜片的内皮细胞活性达到或超过 4 14 d 的保存方
10、法。透明质酸, 作为相对分子质量 1. 5 % 106的高分子聚合物, 是构成玻璃体的主要成 分, 近年来已广泛应用于眼科的临床领域。Ogino 等 1借鉴 Optisol 处方, 加入 100 g L- 1的透明质酸 钠制成角膜保存 通过与角膜内皮细胞的 HA 膜受体 CD44 结合, 加厚了组织表面的保护膜; 调节内皮细 胞的移行、 增生、 分化过程, 以及通过胶渗作用维持 角膜相对透明, 减轻角膜水肿。然而与硫酸软骨素 相比, 它不具有天然的抗脂质过氧化的功能, 且角膜 为易受氧化损伤的组织之一, 尤其是 Na+?K+?AT P 酶很容易受到活性氧的损伤。在生理状态下, 房水 和角膜组织
11、中的维生素 C 和还原型谷胱甘肽具有清 除自由基, 维持细胞正常结构和功能的作用。Sanje? va 等在单纯 K 液和加入了维生素 C、 E、 A 及还原型 谷胱甘肽的 K 液中对比保存兔和人的角膜, 观察保 存后的角膜内皮超微结构变化, 发现添加抗氧化剂 组的内皮细胞形态好于单纯 K 液组。Serbecic 等 3研究发现抗氧化维生素族具有阻止角膜内皮细胞质 脂过氧化和减少细胞凋亡的作用。Panda 等 4在 MK 液加入地塞米松的基础上再加入 0. 92 g L- 1还原型谷胱甘肽, 使狗角膜内皮细胞活性由 10 d 进 一步延长为 12 d, 认为加入还原型谷胱甘肽是改善 角膜中期保存
12、液的较好方法。可见, 谷胱甘肽与维 生素 C 具有清除各种自由基以防止自由基对角膜的 损伤, 维持细胞膜的完整性, 参与胶原合成, 促进创 伤修复的作用。 基于以上思想, 为了探索新的角膜保存介质, 研 制价格低廉, 保存效果明显的角膜中期保存液, 本试 验参考 MK 液的配方引入外源性的透明质酸钠和抗 氧化剂( 还原型谷胱甘肽和维生素 C) , 对保存 3 d、 7 d、 10 d、 14 d 的兔角膜行大体形态观察、 角膜中央厚 度测量、 台盼蓝?茜素红联合染色及电镜观察。结果 显示: 实验组保存的角膜内皮细胞各项指标均好于 对照组, 统计学处理有显著性差异( P 0. 01) 。植片 的
13、水肿、 过厚, 会严重影响穿透性角膜移植术的手术 操作, 2 组保存液随保存时间延长, 对照组角膜水肿 严重, 厚度较实验组明显增厚( P 0. 01) 。1953 年,Stocker 发现角膜内皮细胞是维持角膜透明的基础, 因此角膜保存的关键是保护角膜内皮细胞。本实验 采用赵江月等 5对角膜内皮细胞损伤不明显的台盼 蓝?茜素红联合染色。台盼蓝?茜素红联合染色计算 角膜内皮活细胞百分率已成为衡量角膜保存活性的 关键指标。台盼蓝能通过受损、 死亡细胞膜使细胞 核着染呈淡蓝色, 茜素红与细胞间质中的钙结合发 生红染, 正常活性角膜内皮细胞六角形边界清晰, 间 质呈粉红色, 严重损伤的内皮细胞轮廓不
14、清, 边界模 糊。实验显示, 实验组保存的兔角膜内皮细胞形态 较好, 核蓝染细胞较少, 各时间点的活细胞百分率均 明显高于对照组( P 0. 01) 。采用冀建平等 6扫描 电镜观察角膜内皮细胞的方法和透射电镜观察亦显 示实验组保存 14 d 的大部分兔角膜内皮细胞仍具有 生物活性。可见, 联合应用透明质酸钠和抗氧化剂 ( 还原型谷胱甘肽和维生素 C) 的改良 MK 液在维持 角膜内皮细胞的形态、 活性以及减轻角膜水肿等方 面取得了相对较好的保存效果。然而, 仍有许多诸 如高分子聚合物的适宜浓度, 物质的相互作用及联 合作用机制等问题有待于进一步的具体研究。 综上可见, 透明质酸钠及抗氧化剂具
15、有减轻角 膜组织损伤, 保持细胞活性的作用, 将二者联合应用 于角膜中期保存液中, 可显著提高保存效果。为探 索保存方法简便、 行之有效的中期保存液提供了可 靠的实验依据。参考文献1? Ogino H, Yukari K, Terada H, Sawa M. Effect of a newly developed corneal storage medium on corneal endotheli? um ?morphological study by scanning electron microscopy J. Nippon Ganka Gakkai Zasshi 1995; 99(4)
16、: 387 ?391. 2? 杨? 娟, 赵? 敏, 李? 鸿, 徐智勇. 应用透明质酸钠保存角膜的实 验研究J. 中国医师杂志 2005; 7(3): 309 ?311. 3 ? Serbecic N, Beutelspacher SC. Anti?oxidative vitamins prevent lipid?peroxidation and apoptosis in corneal endo? thelial cells J. Cell Tissue Res 2005; 320(3): 465 ?475. 4? Panda A, Kumar G, Basak SK, Mohan M, Gupta SK. The effects of corticosteroid and reduced glutathione on the endothelial viability during culture in MK medium A light microscopy study J. A cta Ophthalmol
