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1、核酸分子核酸分子 杂交技术杂交技术第一节第一节 核酸分子核酸分子 杂交技术杂交技术 的基本原理的基本原理一、核酸分子杂交的概念一、核酸分子杂交的概念核酸分子杂交核酸分子杂交是指来源不同是指来源不同 的具有互补序列的两条核酸单的具有互补序列的两条核酸单 链，在一定条件下，按碱基配对链，在一定条件下，按碱基配对 原则结合成杂化双链的过程。原则结合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为杂交的双方分别称为探针探针 （即杂交体系中的已知核酸序列）（即杂交体系中的已知核酸序列） 和和待测核酸待测核酸，杂交后形成的异源，杂交后形成的异源 双链分子称为双链分子称为杂交分子杂交分子。 探针：是指能与核酸分子中探针
2、：是指能与核酸分子中 特定片段互补结合并带有可检测特定片段互补结合并带有可检测 标记的核酸分子或寡核苷酸片段。标记的核酸分子或寡核苷酸片段。核酸分子杂交过程一般需要核酸分子杂交过程一般需要 经历了核酸的变性和复性两个阶经历了核酸的变性和复性两个阶 段。段。变性变性复性、杂交复性、杂交复性、杂交复性、杂交二、核酸的变性与复性二、核酸的变性与复性 （一）（一）DNADNADNADNA的变性的变性 （denaturationdenaturationdenaturationdenaturation） 1 1 1 1、概念概念DNADNADNADNA分子在某些理化因素的分子在某些理化因素的 作用下，其两
3、条互补链之间的氢作用下，其两条互补链之间的氢 键发生断裂，双螺旋结构松开分键发生断裂，双螺旋结构松开分 成两条单链。这一过程，称为成两条单链。这一过程，称为 DNADNADNADNA变性。变性。DNADNADNADNA变性的变性的 常用方法常用方法热变性热变性酸碱变性酸碱变性化学试剂变性化学试剂变性2 2 2 2、DNADNADNADNA变性的常用方法变性的常用方法（1 1 1 1）热变性）热变性30 50 70 90 10030 50 70 90 10030 50 70 90 10030 50 70 90 1001.51.51.51.5 1.41.41.41.4 1.31.31.31.3 1
4、.21.21.21.2 1.11.11.11.1 0 0 0 0DNADNADNADNA热变性曲线热变性曲线A A A A260260260260 C C C C TmTmTmTm增色效应：增色效应：核酸分子在变性过程中，其核酸分子在变性过程中，其 溶液的溶液的A A A A260260260260会增大，此现象称为增会增大，此现象称为增 色效应。色效应。融解温度（融解温度（melting melting melting melting temperature , Tmtemperature , Tmtemperature , Tmtemperature , Tm）：）：DNADNADNADN
5、A分子热变性程度达到分子热变性程度达到 50505050%时所对应的温度，称为融解时所对应的温度，称为融解 温度或解链温度。温度或解链温度。TmTmTmTm的影响因素：的影响因素：DNADNADNADNA分子的碱基组成分子的碱基组成 TmTmTmTm与与DNADNADNADNA分子碱基组成的关系分子碱基组成的关系 Tm=(G+C)Tm=(G+C)Tm=(G+C)Tm=(G+C)% 0.41+69.30.41+69.30.41+69.30.41+69.3从上述关系可看出，从上述关系可看出，DNADNADNADNA变变 性解链是一个区域一个区域发生性解链是一个区域一个区域发生 的，的，ATATAT
6、AT富集区先解链，富集区先解链，GCGCGCGC富集富集 区后解链。因此，区后解链。因此，DNADNADNADNA变性曲线变性曲线 应是阶梯式的。应是阶梯式的。溶液的离子强度溶液的离子强度一般情况下，在低离子强度一般情况下，在低离子强度 溶液中，溶液中，DNADNADNADNA的的TmTmTmTm较低，且解链较低，且解链温度范围较宽；在高离子强度溶温度范围较宽；在高离子强度溶 液中，液中，TmTmTmTm较高，解链温度范围较较高，解链温度范围较窄。窄。 pHpHpHpH一般情况下，核酸溶液的一般情况下，核酸溶液的pHpHpHpH 在在59595959范围内，范围内，DNADNADNADNA的的
7、TmTmTmTm变化不变化不 明显；当溶液的明显；当溶液的pHpHpHpH11111111时，时， DNADNADNADNA的的TmTmTmTm会降低。会降低。变性剂变性剂变性剂可降低变性剂可降低DNADNADNADNA的的TmTmTmTm（2 2 2 2）酸碱变性）酸碱变性核酸溶液核酸溶液pHpHpHpH10101010时，核时，核 酸分子的双链完全打开。酸分子的双链完全打开。常用碱变性法。常用碱变性法。 （3 3 3 3）化学试剂变性）化学试剂变性常用的化学试剂有：尿素、常用的化学试剂有：尿素、 甲酰胺、甲醛等。甲酰胺、甲醛等。3 3 3 3、变性、变性DNADNADNADNA分子理化性质
8、的变分子理化性质的变 化：化： （1 1 1 1）黏度降低）黏度降低 （2 2 2 2）密度增加）密度增加 （3 3 3 3）沉降系数增加）沉降系数增加 （4 4 4 4）A A A A260260260260吸光度值增加吸光度值增加 （5 5 5 5）细菌转化能力消失）细菌转化能力消失（二）（二）DNADNADNADNA的复性的复性（renaturationrenaturationrenaturationrenaturation）1 1 1 1、概念概念变性变性DNADNADNADNA的两条互补单链，的两条互补单链，在适当条件下在适当条件下, , , ,重新结合恢复双螺重新结合恢复双螺旋结构
9、的过程，称为旋结构的过程，称为DNADNADNADNA的复性。的复性。2 2 2 2、影响复性或杂交的因素、影响复性或杂交的因素 （1 1 1 1）核酸分子的浓度和长度）核酸分子的浓度和长度 核酸复性反应方程式：核酸复性反应方程式：dC/dt=kCdC/dt=kCdC/dt=kCdC/dt=kC2 2 2 2 当当T=0T=0T=0T=0时，时，C=CC=CC=CC=C0 0 0 0，则：，则：C/CC/CC/CC/C0 0 0 0=1/(1+kC=1/(1+kC=1/(1+kC=1/(1+kC0 0 0 0t) t) t) t) 当当t=tt=tt=tt=t1/21/21/21/2时时, C
10、/C, C/C, C/C, C/C0 0 0 0=0.5=0.5=0.5=0.5，则：，则：C C C C0 0 0 0 t t t t1/2 1/2 1/2 1/2 =1/k=1/k=1/k=1/k在杂交反应过程中，探针的在杂交反应过程中，探针的浓度和长度通常是：浓度和长度通常是：浓度：浓度：0.10.50.10.50.10.50.10.5 g g g g长度：长度：50300bp50300bp50300bp50300bp（2 2 2 2）温度）温度一般情况下，一般情况下，复性温度复性温度=Tm=Tm=Tm=Tm 20202020 C25C25C25C25 C C C C寡核苷酸探针杂交反应
11、通常在寡核苷酸探针杂交反应通常在TmTmTmTm 5 5 5 5 C C C C下进行。下进行。 确定杂交反应温度时应考虑确定杂交反应温度时应考虑 以下几点因素：以下几点因素：TmTmTmTm每降低每降低 11.511.511.511.5 C C C C，错配率增加，错配率增加1%1%1%1%； RNA-DNARNA-DNARNA-DNARNA-DNA杂交体的稳定性较杂交体的稳定性较 DNA-DNADNA-DNADNA-DNADNA-DNA杂交体高，杂交体高，TmTmTmTm应相应应相应 增加增加1015101510151015 C C C C；采用采用RNARNARNARNA探针探针 时，加
12、入适量的甲酰胺，以降低时，加入适量的甲酰胺，以降低 Tm;Tm;Tm;Tm;寡核苷酸探针的寡核苷酸探针的TmTmTmTm：Tm=4(G+C)%+2(A+T)%Tm=4(G+C)%+2(A+T)%Tm=4(G+C)%+2(A+T)%Tm=4(G+C)%+2(A+T)%（3 3 3 3）离子强度）离子强度 （4 4 4 4）甲酰胺）甲酰胺 （5 5 5 5）核酸分子的复杂性）核酸分子的复杂性 （6 6 6 6）非特异性杂交反应）非特异性杂交反应常用非特异性位点封闭物：常用非特异性位点封闭物：变性的非特异性变性的非特异性DNADNADNADNA：如鲑：如鲑 鱼精子鱼精子DNADNADNADNA，小牛
13、胸腺，小牛胸腺DNADNADNADNA高分子化合物：如高分子化合物：如DenhardtDenhardtDenhardtDenhardt 溶液，脱脂奶粉溶液，脱脂奶粉 第二节第二节 核酸分子核酸分子 杂交技术杂交技术 的基本方法的基本方法液相杂交液相杂交液相杂交液相杂交杂交反应在均匀的液相中进行。通过羟基磷灰石杂交反应在均匀的液相中进行。通过羟基磷灰石杂交反应在均匀的液相中进行。通过羟基磷灰石杂交反应在均匀的液相中进行。通过羟基磷灰石吸附、亲和吸附、磁珠吸附方法捕获探针吸附、亲和吸附、磁珠吸附方法捕获探针吸附、亲和吸附、磁珠吸附方法捕获探针吸附、亲和吸附、磁珠吸附方法捕获探针- - - -靶杂交
14、靶杂交靶杂交靶杂交体。体。体。体。固相杂交固相杂交固相杂交固相杂交SouthernSouthern杂交杂交 Northern Northern 杂交杂交 点杂交点杂交/ /狭缝杂交狭缝杂交 菌落杂交菌落杂交 原位杂交原位杂交核酸分核酸分子杂子杂交交技术的基技术的基本方法本方法DNADNADNADNA片段在琼片段在琼 脂糖凝胶上电泳脂糖凝胶上电泳 分离分离膜上固定膜上固定 DNADNADNADNA片段片段在缓冲液中将在缓冲液中将 标记的探针加标记的探针加 到膜上到膜上DNADNADNADNA片段从琼脂片段从琼脂 糖凝胶上转印到糖凝胶上转印到 膜上膜上杂交信号的杂交信号的 检测检测一、一、Sout
15、hernSouthernSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交SouthernSouthernSouthernSouthern印迹杂交是一种印迹杂交是一种DNADNADNADNA与与DNADNADNADNA的分子杂交法。的分子杂交法。（一）待测（一）待测DNADNADNADNA样品的制备样品的制备 1 1 1 1、提取待测、提取待测DNADNADNADNA 2 2 2 2、限制酶消化、限制酶消化 DNADNADNADNA（二）电泳分离酶切（二）电泳分离酶切DNADNADNADNA片段片段 常用电泳方法：常用电泳方法： 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）凝胶中核酸变性（三）凝胶中核酸变性1 1 1 1、碱变性、碱变性2 2 2
