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1、Cell Transplantation, Vol. 17, pp. 35-41. 2008 Cropreservation of Mouse Adipose Tissue-Derived Stem/Progenitor Cells 冷冻保存小鼠脂肪组织来源的干细胞冷冻保存小鼠脂肪组织来源的干细胞/祖细胞祖细胞（翻译翻译） 摘要摘要 有报道，脂肪组织来源的干细胞/祖细胞（ASCs）不仅可分化为中胚层细胞，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，也可分化为内胚层细胞，例如肝细胞、胰岛素分泌细胞。这类干细胞/祖细胞有望用于各种再生治疗。本研究证明用七种冻存液，包括 10%DMSO、DMSO 细胞冷冻液、甘
2、油细胞冷冻液、CellBanker1、CellBanker1+、CellBanker2 和 CP-1，冻存得 ASC 有细胞活性及成脂/成骨分化潜能。ASCs 取自小鼠皮下脂肪组织。用 CellBanker2 冻存的 ASCs 的细胞活性超过 90%，CellBanker1、CellBanker1+或 CP-1 保存的约有 90%活性，10%DMSO、DMSO 细胞冷冻液、甘油细胞冷冻液保存 ASC 活性低于 80%。用与没用 CellBanker2 保存的细胞在成脂/成骨分化潜能上没有区别。数据显示，CellBanker2 是 ASCs 冷冻保存的最有效的解决方法，冻存 ASCs 及非冻存
3、ASCs 都可用于再生医疗。 介绍介绍 干细胞存在于多种器官，包括骨髓、肝脏、胰脏、脂肪。骨髓间充质干细胞（MSCs）是多潜能细胞， 可在体内和体外诱导分化成多种功能的中胚层组织，包括骨、软骨、腱、脂肪以及骨髓基质。数项研究显 示 MSCs 可分化成其他类型的组织特异性细胞，例如骨骼肌、肝脏和中枢神经系统的细胞。中枢神经系统含 有可分化成造血干细胞或骨骼肌细胞的干细胞。 这些结论提示多潜能 MSCs 在再生医学组织工学方向上使用 广泛。近来，脂肪组织被视作另一个 MSCs 的来源。因为脂肪组织的 MSCs 比骨髓来源的 MSCs 更容易获得， 脂肪组织来源的干细胞/祖细胞（ASCs）有望与其他
4、干细胞用于临床研究。ASCs 有自我更新的能力，可经诱 导分化多种间充质组织，包括软骨细胞，脂肪细胞，肌细胞和内皮细胞。 随着冻存细胞技术的进步，冷冻保存对细胞研究者更有意义，其应用包括干细胞运输，收集细胞以达 到治疗剂量，安全完成任务节省时间和质控检测。然而，有研究报道冻存对干细胞、祖细胞的不利影响。 冻融细胞的最终存活率体现了多种损伤细胞的机制对细胞的综合影响。如果用快速冷却法保存，那么溶液 无法维持平衡，因为细胞外溶液的化学势降低的速率远大于水分从细胞中扩散的速率。这种不平衡的最终 结果则是可观察到细胞内形成冰晶，这对细胞是致命的。冷却速度是决定冻存干细胞活性的关键因素。在 复苏时也存在
5、相似的不利影响。含 DMSO 或甘油的冷冻保存液可用于解决这种影响。在骨髓移植应用中， 多数研究机构冻存骨髓用的是含 10%DMSO 的冻存液，然后在程序降温仪中以 1/min 的速率冷冻。然而， 一些研究指出细胞接触到 DMSO 会损失一定的祖细胞活性。因此，有必要使用专用的对干细胞、祖细胞无 害的冻存液。 虽然几项研究报道了冻存干细胞/祖细胞的效果是基于保存时间和冻融速度，但少有研究报道不同冻存 液的影响作用。本研究中，7 种冻存液经过了一系列测试确定处哪一种冻存小鼠 ASCs 效果最佳。 Cell Transplantation, Vol. 17, pp. 35-41. 2008 材料和
6、方法材料和方法 【分离和培养小鼠脂肪组织来源的干细胞、祖细胞分离和培养小鼠脂肪组织来源的干细胞、祖细胞】 1. 皮下脂肪组织取自 8 周龄成年小鼠； 2. 脂肪组织重 0.5g，用 Hanks 平衡盐溶液洗三次，切细，用 1ml I 型胶原酶（1mg/ml）消化，37水浴 孵育 1 小时，并来回震荡； 3. 250m 筛网过滤消化的组织，细胞悬于含 20%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基； 4. 室温下细胞 1200rpm 离心 5 分钟，收集的细胞在培养前清洗三次； 5. T-25 培养瓶添加含 20%FBS 的 DMEM/F12 培养基，100U/ml 青霉素，100g/ml 链霉素，
7、接种 1*105个细 胞，37、5%CO2培养； 6. 细胞传代 3-4 代。 【小鼠脂肪组织来源干细胞小鼠脂肪组织来源干细胞/祖细胞的冻存和细胞活性祖细胞的冻存和细胞活性鉴定鉴定】 1. 接近长满的时候，细胞密度大约 2.5-6.5*104 cell/cm2，胰酶 EDTA 消化小鼠 ASCs，离心后以 2*105 cell/ml 的密度悬浮于七种冻存液中； 2. 冻存液有 10%DMSO，DMSO 细胞冻存液，甘油细胞冻存液，CellBanker1，CellBanker1+，CellBanker2， CP-1； 3. 冻存液中的细胞迅速冷却，保存在-80 7 天； 4. 融化细胞后，迅速用
8、培养基稀释细胞； 5. 细胞 1200rpm 离心 3 分钟，重悬在 5ml 培养基中； 6. 细胞活性用台盼蓝染色法测定。 【成脂成脂细胞细胞分化分化鉴定鉴定】 1. 诱导方法诱导方法： 含 100M 吲哚美辛 （消炎痛） 、 1M 地塞米松、 1M 氢化可的松、 10g/ml 胰岛素、 10%FBS 的 DMEM 高糖培养基，培养细胞 3 天。此后用含 10%FBS 的 DMEM 高糖培养基培养一周； 2. 分化鉴定分化鉴定：油红 O 染料（Oil Red O）染细胞内脂滴可鉴定细胞分化情况。ASCs 在成脂培养基中培养 1 周，然后固定于含 10%甲醛的 PBS 十分钟，用 60%异丙醇
9、清洗，油红 O 染色 10 分钟，多次清洗，100% 异丙醇脱色 1 分钟； 3. 积聚性积聚性甘油三酸鉴定甘油三酸鉴定：甘油三酸 E-TestTM试剂盒，在前述的细胞样品中测试。细胞培养瓶用 50mM Tris 缓冲液 （pH 7.4） 清洗， 细胞脱落后 4离心 1200rpm 5 分钟， 然后悬浮在含 50mM Tris 缓冲液、 5mM EDTA、 -巯基乙醇的提取缓冲液，超声波处理，最后取 20l 样品溶液用作鉴定。 【成骨细胞分化鉴定成骨细胞分化鉴定】 1. 诱导方法诱导方法：含 100M 地塞米松、50M 抗坏血酸-2-磷酸、10M -甘油磷酸、10%FBS 的 DMEM 培 养
10、基，培养细胞 2-3 周； 2. 分化鉴定分化鉴定：von Kossa 法检测细胞外基质钙化。用萘酚 AS MX-PO4，N-N-二甲基甲酰胺，红紫 LB 盐， Tris-HCL(pH 8.3)染色 45 分钟，再用 2.5%硝酸银溶液染色 30 分钟（Von Kossa 法） 。 【增殖速率的测量增殖速率的测量】 非冻存的或冻存的 ASCs 以 3.3*104 cell/每孔的密度接种到 6 孔板中，胰酶 EDTA 消化，细胞传代，3、5、 7 天后细胞计数。活细胞用台盼蓝染色计数。 Cell Transplantation, Vol. 17, pp. 35-41. 2008 结果结果 【脂
11、肪组织来源的干细胞脂肪组织来源的干细胞/祖细胞祖细胞】 本实验测试的是小鼠 ASCs（见图 1A） 。为了测试收获细胞的成脂分化能力，细胞用成脂培养基培养 1 周，诱导分化，然后进行油红 O 染色。该染色显示细胞为阳性，意味着细胞具有成脂分化能力（图 1B） 。 为测试收获细胞的成骨分化能力，细胞用成骨培养基培养了 1 周，然后进行 von Kossa 染色。该染色显示细 胞为阳性，意味着该细胞具有成骨分化能力（图 1C） 。这些结果都表明分离得到的细胞内包含了脂肪组织来 源的干细胞。 【冻存冻存 ASCs 的细胞活性的细胞活性】 小鼠 ASCs 冻存了一周。 冻存液有 10%DMSO, DM
12、SO 细胞冻存液， 甘油细胞冻存液， CellBanker1， CellBanker 1+，CellBanker2 和 CP-1。融化细胞后，迅速用台盼蓝评估细胞活性。图 2 表明 CellBanker2 冻存的 ASCs 活 性超过 90%，CellBanker1、CellBanker1+、CP-1 的活性约为 90%。而 10%DMSO、DMSO 冻存液、甘油冻存液 的活性则低一个档次。CellBanker2 冻存的细胞具有 7 种冻存液中最高的活性。 【对比对比冻存的和非冻存的冻存的和非冻存的 ASCs 增殖速率增殖速率】 测定冻存的和非冻存细胞的增殖速率，细胞在培养第 3、5、7 天计
13、数（图 3） 。非冻存的小鼠 ASCs 显示 比冻存细胞更高的增殖速率。CellBanker2 冻存的细胞增殖速率最快。 【冻存冻存 ASCs 的成脂的成脂/成骨分化能力成骨分化能力】 为测试冻存细胞（图 4A）是否有成脂分化能力，细胞成脂诱导培养了一周，然后进行油红 O 染色。冻 存在 CellBanker2 （图 4B） 或其他冻存液的细胞经油红 O 染色确定为阳性， 说明冻存细胞具有成脂分化能力。 为测试冻存细胞是否有成骨分化能力，细胞成骨诱导培养了一周，然后进行 von Kossa 染色。冻存在 CellBanker2（图 4C）的细胞经 von Kossa 染色确定为阳性，说明冻存细
14、胞具有成骨分化能力。这些数据说明 冻存细胞具有成脂/成骨分化能力。 【对比冻存的和非冻存的对比冻存的和非冻存的 ASCs 的成脂分化能力的成脂分化能力】 为测定冻存的和非冻存的 ASCs 的成脂分化能力，采用甘油三酸 E-testTM法鉴定分化细胞内积累的甘油 三酸。冻存细胞和非冻存细胞在成脂诱导分化一周后进行的积累性甘油三酸测定中未显示明显差异（图 5） 。 讨论讨论 MSCs 是多潜能细胞，有能力分化成中胚层组织的多种功能细胞类型。数项研究显示多潜能 MSCs 在再 生医学组织工程方向上很有用。骨髓细胞一直被作为 MSCs 的来源。而 ASCs 有也骨髓样特性。据报道，ASCs 在体外分化
15、成间充质系的细胞，正如本研究所示的脂肪细胞、骨细胞，以及软骨细胞、肌细胞，还可以生 成肝细胞、胰岛素分泌细胞和神经细胞。 冻存技术已经常规用于保存动物和人体的所有细胞/组织。在再生治疗领域，冻存的骨髓据研究所示可 以用于骨髓转移。早期采集骨髓可能更为有效，因为有研究认为年轻人的骨髓比年长者含有更多间充质干 细胞。因此，年轻患者身上采集的间充质细胞可以当作高增殖、高分化特性的细胞库而冻存下来，以在未 来用于他自身的治疗。本研究显示，冻存的小鼠 ASCs 保留有成脂/成骨分化能力。 在冷冻前，细胞必须置于冻存液中（DMSO 或甘油） 。研究表明，DMSO 加入培养基后，不仅有细胞毒 性， 还能诱导
16、神经元样细胞或心脏肌细胞的分化。 有些研究小组使用非毒性冻存液例如海藻糖来代替 DMSOCell Transplantation, Vol. 17, pp. 35-41. 2008 冻存干细胞。本研究检测了 7 种冻存液。成脂诱导一周后细胞内含积累性甘油三酸量在冻存细胞和非冻存 细胞之间没有明显差别。然而，非冻存的小鼠 ASC 显示出最高的增殖速率。对于 7 种冻存液，cellbanker2 冻存的细胞在所有冻存的小鼠 ASCs 中有最高的增殖速率。对冻存 ASCs 活性的研究显示 CellBanker2 是 ASCs 最有效的冻存液。通过对比细胞的成脂/成骨潜能，可发现冻存的和非冻存的细胞在成脂/成骨潜能上没有差 异。这些结果都表明冻存细胞，特别是通过 CellBanker2 冻存的，与未冻存的 ASCs 可成功用于再生治疗。 参考文献（略） Cell Transplantation, Vol. 17, pp. 35-41. 2008
