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1、*SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍宝日医生物技术（北京）有限公司SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍2*主 要 内 容1SMARTerTM VS 传统cDNA合成技术2SMARTerTM 技术概要 3Clontech相关产品SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍3*1SMARTerTM VS 传统cDNA合成技术SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍4*DNA pol extends 3 ends, displacing next RNA pieceAAAAA53(start)(stop) mRNA transcript (poly A+ RNA)AAA
2、AA53 TTTTTTTTTTAAAAAAAAAA TTTTT35AAAAA TTTTToligo primer53Prime mRNA with oligo primer RT extends primer RNase H DNA pol DNA LigaseSecond Strand Enzyme CocktailRNase H creates nicks in RNALigase ligates segments“Gubler and Hoffman procedure” (Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983) Gene 25:263 - 269)传统cD
3、NA合成技术SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍5*SMARTTM 技术SMARTTemplateRNASwitchingMechanismAt the end of末端转移酶活性自动转换模板功能SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍6*什么是SMARTerTM 技术?SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍7*SMARTerTM技术原理图5Poly A 3Poly A+ RNA修饰的 Oligo (dT) 引物XXXXX逆转录酶到达mRNA模板末端时 ，自动在新合成的全长cDNA 的 末端添加几个dX。第一链cDNA合成及dX加尾5Poly A 3模板转换和RT延伸5
4、Poly A 3SMARTer Oligo 或 SMART T7 OligoXXXXXSMARTer Oligo 与dX互补 ，cDNA以SMARTer Oligo 为模板继续延伸。获得带有接头序列的第一链cDNA第一链cDNA一步反应SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍8*第一链cDNA各 种 应 用RACEPCR, qPCR文库构建消减杂交新一代测序探针制备正义RNA扩增LD-PCR扩增ds cDNASMARTerTM (SMARTTM)技术介绍9*SMART技术的特点SMARTerTM技术特点只需纳克级总RNA就可以合成高质量的双链cDNA保持原有相对丰度的基础上扩增mRNA通
5、过 LD-PCR扩增cDNA单酶反应，一管操作SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍10*2SMARTerTM 技术概要SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍11*SMARTerTM 技术概要SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍12*图1. SMARTScribeTM RT 获得更长的第一链cDNA 。 polyA+ RNA 为模板。SMARTScribeTM RT合成更长的第一链cDNASMARTerTM (SMARTTM)技术介绍13*SMARTScribeTM RT获得14.6 kb以上的cDNA片段SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍14*图 2.
6、利用SMARTScribe RT 和合成的RNA 为模板进行RT-PCR分析。 合成的RNA模板进行一系列的梯度稀释后，样品中含有105 -10RNA的拷贝。在的RNA模板中添加 50 ng 的 HeLa 细胞总RNA，以增加模板的复杂度。使用Advantage 2 DNA Polymerase Mix合成第二链 。36个循 环后获得350bp片段。SMARTScribeTM RT灵敏度高Lane M: 100bp DNA size marker.SMARTScribe RT可以从低至10个RNA拷贝中合成第一链cDNA。SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍15*图 3. Human
7、 Universal Total RNA 梯度稀释后采用SMARTScribe RT及P 、Q公 司的逆转来酶进行反转录 。取1l 的RT产物用于 PCR 扩增beta-actin 5端的 300bp片段。SMARTScribeCompetitor PCompetitor Q1 ug100 ng10 ng1 ng100 pg10 pg1 pg0.1 pgSMARTScribeTM RT：比竞争产品更灵敏SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍16*3Clontech相关产品SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍17*SMARTerTM技术相关产品SMARTerTM (SMARTT
8、M)技术介绍18*RACE 产品l提供SMARTScribeTM RTl包含升级的SMARTer oligonucleotidel只需10ng的总RNAl可获得完整的5 端和3端序列l操作简便l随机引物用于poly ARNA反转录实验特 点SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit产品编号：634923 / 634924SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍19*Poly A+ 或Total RNA (10 ng - 1 g)SMARTerTM 合成一链 cDNA 标准方法合成一链 cDNA5 RACE 片段3 RACE 片段5 RACE-Ready c
9、DNA3 RACE-Ready cDNARACE产物克隆、测序5 RACE PCR3 RACE PCR全长cDNASMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit1-2天SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍20*实 验 结 果Lane M: 1 kb DNA marker. Lanes 1 & 2: tyrosyl-tRNA synthetase (YARS). Lanes 3 & 4: interferon- receptor (IFNGR1). Lanes 5 & 6: transferrin receptor (TFR). 图6. 采用人胎盘总RNA进
10、行5- RACE和3-RACE。 SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍21*Human geneSize of mRNA (kb)+(bp)*Matches genomic sequencesIncludes Transcription start siteTransferrin receptor5.0+25yesyesSmooth muscle g-actin1.28+31yesyesVascular smooth muscle - actin1.33+17yesyesCytoskeletal -actin1.9+1yesyes23 kDa HBP0.67+9yesyesp532.
11、6+4yesyesInterferon- receptor2.06+14yesyes14-3-3 protein1.03+1n/an/aInterferon- receptor2.75+17yesyesSMARTer RACE获得更长的5末端n/a = not available * Compared to GenBank cDNA sequence.SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍22*u 可以从低至1ng的总RNA中合成高质量的cDNA合成双链cDNA相关产品SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit（634925/634926）SMARTerTM Pi
12、co PCR cDNA Synthesis Kit （634928）起始量21,000 ng 总RNA，体积 3.5 l11,000 ng 总RNA，体积 50 lRNA最低浓度total RNA 0.6 ng / ltotal RNA 20 pg / l第一链cDNA 合成及后续实 验操作 反应体积 = 10 l 第一链cDNA合成产物用TE稀释，取部 分用于PCR扩增 PCR扩增后用NucleoSpin柱纯化反应体积 = 106 l 第一链cDNA合成产物NucleoSpin柱纯化用 于PCR扩增 PCR扩增后用NucleoSpin柱纯化ds cDNA产量12 g12 gSMARTerTM
13、 (SMARTTM)技术介绍23*SAMRTerTM技术合成ds cDNA消减杂交Virtual Northerns构建 cDNA文库制备探针 新一代测序PCR qPCR应 用SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍24*构建cDNA文库相关产品构建TriplEx2噬菌体文库可在任意质粒的任意位点定向构建 高品质的cDNA文库SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍25*SMARTTM cDNA Library Construction Kit可以以3种读码框架翻译插入片段，因此可以进行文库免疫筛选。产品编号：634901在TriplEx2噬菌体载体中构建cDNA文库SMARTer
14、TM (SMARTTM)技术介绍26*In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit产品编号：634933任意 线性化载体PCR产物任意 线性化载体重组载体SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍27*In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction KitSMARTerTM 技术可在任意质粒的任意位点定向插入cDNA，构建高品质的cDNA文库+In-Fusion 克隆技术产品编号：63493390%SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍28*SMARTTM mRNA Amplification Kit（产品编号：635001）T7双链cDNA5Poly A 35Poly A 35Poly A 35Poly A 35Poly A 3T7 in vitro transcriptionl 可从100ng总RNA中线性扩增得到数十微克的mRNAl 保持mRNA原有的相对丰度线性扩增mRNA产品SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍29*： ：800-810-6261；010-80720985 / 86： 我们将竭诚为您服务！技 术 服 务SMARTerTM (SMARTTM)技术介绍30*Thank You ！30
