《1治疗肝疾方剂抗人类b型肝炎病毒作用之探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1治疗肝疾方剂抗人类b型肝炎病毒作用之探讨（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1治療肝疾方劑抗人類治療肝疾方劑抗人類 B 型肝炎病毒作用之探討型肝炎病毒作用之探討六個傳統中藥複方抗人類六個傳統中藥複方抗人類 B 型肝炎病毒作用之研究型肝炎病毒作用之研究黃瑞齡1，陳建志1，張永勳2，張成國2，陳介甫1，謝明村 21國立中國醫藥研究所 台北2中國醫藥學院 台中(1999 年 7 月 19 日受理，1999 年 9 月 9 日收校訂稿，1999 年 9 月 14 日接受刊載)摘摘 要要柴胡疏肝散、加味逍遙散、一貫煎、血府逐瘀湯、甘露消毒丹及葉天士肝炎方等六個中藥複方。首先以酵素連結免疫吸附法(ELISA)分析測定 B 型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)及 e 抗原(HBeAg)
2、的抑制為指標，結果顯示（1）柴胡疏肝散、加味逍遙散、一貫煎及血府逐瘀湯，對 B 型肝炎病毒表面抗原及 e 抗原無抑制作用，亦無顯著細胞毒害作用。 （2） 甘露消毒丹的甲醇抽取物，在劑量 200 g/ml，無細胞毒害作用下，具有抑制 B 型肝炎病毒表面抗原之作用（P 0.01），其抑制作用隨劑量之增加而增強，其抑制百分比於給藥處理第九天達到最高為 32.5%。（3）葉天士肝炎方的甲醇抽取物，在劑量 200 g/ml，無細胞毒害作用下，具有抑制 B 型肝炎病毒表面抗原（P 0.01）及 e 抗原之作用（P 0.01），其抑制最高百分比分別為 28.7 及 30.3 %。關鍵詞：B 型肝炎病毒，表面
3、抗原，e 抗原，中藥複方。_ 連絡人：謝明村，中國醫藥學院中國藥學研究所，電話： (04)2053366 轉 1706。23前言前言人類 B 型肝炎病毒感染是引起急性及慢性肝炎的主要病因之一、長期感染極易發展成肝硬化或發生原發性肝癌1-3。危害國人健康至劇，因此抗 B 型肝炎病毒藥物之開發研究為當務之急。人類肝癌細胞株MS-G2，由於此細胞株的染色體上有 HBV DNA 崁入(integrated)，可持續高量地分泌 B 型肝炎病毒顆粒體，為極佳之研究 B 型肝炎病毒複製，及探討藥物活性的體外模式(In Vitro CellCulture Model)4。從天然物(natural produc
4、ts)中尋找具有抗病毒能力之藥物，是近年來重要的研究途徑，尤其從已有臨床依據的中藥方中，尋找抗病毒藥物，更是目前的研究方針。柴胡疏肝散、加味逍遙散、一貫煎、血府逐瘀湯、甘露消毒丹及葉天士肝炎方等六個中藥複方，在臨床上使用已有悠久的歷史，根據記載及臨床經驗得知，具有治療右脅疼痛、黃疸及肝疾的療效。其對於 B 型肝炎病毒之作用值得探討。本研究以 MS-G2 為體外模式，首先以酵素連結免疫吸附法(ELISA)分析測定 B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)及 e 抗原(HBeAg)的抑制為指標，結果顯示僅甘露消毒丹及葉天士肝炎具有抑制 B 型肝炎病毒之作用。材料與方法材料與方法1. 供試藥材之組成、出處
5、、採購供試藥材之組成、出處、採購供試藥材。柴胡疏肝散、加味逍遙散、一貫煎、血府逐瘀湯、甘露消毒丹及葉天士肝炎方等六個中藥複方， 其組成分別為：（1）.柴胡疏肝散景岳全書古方八陣: 陳皮醋炒 6 g、柴胡 6 g、川芎 4.5 g、香附 4.5 g、枳殼麩炒 4.5 g、芍藥 4.5 g、甘草炙 1.5 g. （2）.加味逍遙散內科摘要: 柴胡 30 g、當歸微炒 30 g、白芍 30 g、白朮 30 g、茯苓 30 g、丹皮 30 g、梔子 30 g、甘草微炙赤 15g。 （3）.一貫煎柳州醫話: 北沙蔘 10 g、麥冬 10 g、地黃 30 g、當歸 10 g、杞子 12 g、川楝子 5 g
6、. （4）.血府逐瘀湯醫林改錯:當歸 9 g、生地 9 g、桃仁 12 g、紅花 9 g、枳殼 6 g、赤芍 6 g、柴胡 3g、甘草 6 g、桔梗 5 g、川芎 5 g、牛膝 9 g。（5）.甘露消毒丹續名醫類案:飛滑石 45 g、淡黃芩 30g、綿茵蔯433 g、石菖蒲 18 g、川貝母 15g、木通 15 g、藿香 12 g、連翹 12 g、白蔻仁 12 g、薄荷 12 g、射干 12 g。 （6） .葉天士肝炎方 臨症指南醫案 :黃耆 7.5 g、甘草 7.5g、白朮 7.5 g、生薑 7.5 g、白芍 7.5 g、白扁豆 7.5 g、茯苓 7.5 g、大棗 3.75 g。以上六個供測
7、試之中藥複方，均購自台北春元中藥行。2. 供試樣品之製備供試樣品之製備每一複方之總重量約 100 公克，然後依單方之抽取方式，冷凍乾燥，所得之抽出物，先稱取約 50 毫克進行活性檢測。所剩之抽出物再以甲醇溶解，過濾，濾液濃縮去除甲醇，即得甲醇抽出物，稱取甲醇抽出物約 50 毫克，進行活性檢測。3. 細胞培養細胞培養5人類肝癌細胞株 MS-G2 ，培養於含 10 % 胎牛血清(f e t a l b o v i n e s e r u m , FBS)的 R PMI -1640 培養基(Gi b c o L a b o r a t o r i e s , Gr a n d I s l a n d
8、 , NY ) 中，每毫升的培養基內添加 10 0 I .U.青黴素(p e n i c i l l i n ) 、10 0 g 鏈黴素(s t r e p t o m y c i n ) 、2 .5g防治黴(f u n g i z o n e ) 、2 m M 麩氨酸(L -g l u t a m i n e ) 及 10 0 M 之非必需性氨基酸(n o n -e s s e n t i a l a m i n o a c i d ，包括 14.7 g g l u t a m i c a c i d , 7 .5 g g l y c i n e ,8 .9 g a l a n i n e
9、, 13.3 g a s p a r t i c a c i d , 11.5 g p r o l i n e , 15 g a s p a r a g i n e及 10 .5 g s e r i n e ) ，以上稱完全培養基，置於含 5 % 二氧化碳的 37oC 培養箱中。4. 抗病毒藥物之處理抗病毒藥物之處理在 24 well 的細胞培養皿，每 well 種入 MS-G2 3.0 X 105 細胞，待一天後細胞充分附著於細胞培養皿底部，更新培養基，同時給予三種 (200, 150,及 100g/ml) 不同劑量之供試藥物，每個劑量三重覆。每三天更換一次新的培養基並繼續給予測試藥物。給藥
10、處理第三、六、九及十二天，收集上層培養液，進行抗病毒活性測定。供試藥物溶於三次蒸餾之無菌水者，其對照組亦加入等體積之三次蒸餾之無菌水，若供試藥物溶於 dimethyl sulfoxide (DMSO) 者，其對照組亦加入等體積之 DMSO，DMSO 之劑量最高為 2.5 l/ml。5. Aspartate Aminotransferase (AST)之測定之測定6給藥處理後，收集上層培養液，以 Abbott Vision II AST assay kit 測定 AST值，其單位為 International Unit per Liter，簡稱 I.U./L，用以作為藥物是否具細胞毒性 (cyt
11、otoxicity) 之指標。在 24 well 的細胞培養皿，每 well 種入 MS-G2 3.0 X5105 細胞，其 AST 正常值不超過 25 I.U./L，AST 值隨著細胞壞死的嚴重程度而升高。6. B 型肝炎病毒表面抗原及型肝炎病毒表面抗原及 e 抗原之酵素免疫測定抗原之酵素免疫測定7利用酵素連結免疫吸附分析法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)，使用抗人類 B 型肝炎病毒表面抗原之單株抗體及抗人類 B 型肝炎病毒core/e抗原之多源抗體的酵素免疫檢驗試劑普生生物科技公司 ， 新竹 ， 台灣，利用抗體抗原抗體酵素接合體之三明治複
12、合體，以含過氧化氫的燐苯二氨(OPD) 溶液呈色之，再以分光比色計 DYNATECH MR7000 型 ELISA reader 在490 nm 測定之，所得的吸光值(O.D. value)反應出抗原的多寡。並以對照組的吸光值當 100，依以下公式計算其抑制百分比(Inhibition %)：對照組吸光值-給藥組吸光值 - x 100% = 抑制百分比(Inhibition %)對照組吸光值7. 統計分析統計分析本研究所有結果的數據為三次重覆實驗所得以平均值 標準偏差(Mean S.D.)表之。並以 unpaired students t-test 方法分析其間差異之顯著性。P 值小於 0.0
13、5時則認定其差異具統計學上之意義。結果結果柴胡疏肝散、加味逍遙散、一貫煎、血府逐瘀湯、甘露消毒丹及葉天士肝炎方等六個中藥複方之抗病毒作用的篩選，初步結果如表一所示：（1）柴胡疏肝散、加味逍遙散、一貫煎及血府逐瘀湯等四個中藥複方的甲醇抽取物，在供測試的三個劑量（100、150、200 g/ml），給藥處理六天，對 B 型肝炎病毒表面抗原及 e 抗原均無抑制作用。（2）供測試的六個中藥複方除了一貫煎在劑量 200g/ml，AST 值 26.3 I.U./L，有極輕微的高於正常值 25.0 I.U./L，其餘五個中藥複方均無顯著細胞毒害作用。（3）甘露消毒丹的甲醇抽取物，給藥處理六天，在劑量 150
14、 g/ml 無細胞毒害作用 ， 具有顯著抑制 B 型肝炎病毒表面抗原之作用 （P 0.01），其抑制百分比為 27.5 %，其抑制作用隨劑量之增加而增強，在劑量 2006g/ml，其抑制百分比為 31.1 %（P 0.01）。（4）葉天士肝炎方的甲醇抽取物，給藥處理六天，在劑量 150 g/ml 無細胞毒害作用，具有抑制 B 型肝炎病毒表面抗原（P 0.05）及 e 抗原之作用（P 0.05），其抑制百分比分別為 22.6 及 19.3%，其抑制作用隨劑量之增加而增強，在劑量 200 g/ml，具有顯著抑制 B 型肝炎病毒表面抗原（P 0.01）及 e 抗原（P 0.01）之作用，其抑制百分比
15、分別為27.1 及 26.1 %。為了更進一步探討給藥處理六天呈現抑制病毒作用之甘露消毒丹及葉天士肝炎方二個中藥複方，其作用的時間趨勢及長時間處理的效應，進行給藥處理三、六、九、十二天，監測 B 型肝炎病毒產生的量。結果如圖一，甘露消毒丹的甲醇抽取物在劑量 150 及 200 g/ml，給藥處理三天，就具有抑制 B 型肝炎病毒表面抗原之作用，其抑制百分比分別為 21.8（P 0.05）及 28.2 %（P 0.05），於給藥處理第九天達到最高為 32.5 %， 150 及 200 g/ml 二劑量之間的作用強度差異隨著處理時間的加長漸小。圖二顯示，葉天士肝炎方的甲醇抽取物在劑量 150及 200 g/ml，給藥處理三天，對於 B 型肝炎病毒表面抗原之抑制百分比分別為20.6（P 0.05）及 24.2 %（P 0.05），其抑制 B 型肝炎病毒表面抗原之作用，於給藥處理第九天達到最高為 28.7（P 0.01），也呈現 150 及 200 g/ml 二劑量之間的作用差異漸小的現象。圖三顯示，葉天士肝炎方的甲醇抽取物在劑量150g/ml，給藥處理三、六、九、十二天，對於 B 型肝炎病毒 e 抗原無抑制作用，劑量 200g/ml，對於 B 型肝炎病毒 e 抗原之抑制百分比分別為 22.4、26.7、27.5 及 30.3 %，隨著處理時間的加長抑
