《点亮你的紫激光流式多色技术和紫激光染料应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《点亮你的紫激光流式多色技术和紫激光染料应用（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 点亮你的紫激光|流式多色技术和紫激光染料应用 一、一、 流式流式多色技术的曙光多色技术的曙光405nm 紫激光器的出现紫激光器的出现 1973 年 BD 与美国斯坦福大学合作研发了第一台商品化的流式细 胞仪之后，流式技术的应用得到了不断的推广，促进了科研工作者 研究的深度和广度。但上世纪流式技术的发展受限于激光器以及染 料的发展，大多数研究都停留在6色以下。这种状况直到本世纪初才 得到解决，以这篇文章为分水岭，流式技术超越了6色的界限，向着 更深更广在发展。 文章中采用 BD FACS 系列流式细胞仪，将常用的 6 色流式检测提 高到了 12 色的流式多色分析技术，这在当时是一次非常大的提高
2、。 其中，紫色激光器帮助研究者突破了 10 色的界限，达到了 12 色的新 高度，自此之后流式多色技术蓬勃发展。为什么流式多色技术达到 12 色后如此引人注目？正是因为这项尝试带来了巨大优势和潜力。 流式流式多色技术具有非常突出的优势多色技术具有非常突出的优势： 1、流式细胞群体的分析更加精准精准可靠可靠； 2、细胞功能表征分析落于单细胞层面单细胞层面； 3、稀有细胞的信息更加详细详细真实真实； 4、微量样品数据信息的大大提高大大提高； 5、提高细胞亚群分辨的识别识别精度精度； 紫激光以及染料的发展对于流式多色技术的进步具有至关重要 的意义，在流式多色技术发展中有个非常著名的 Roederer
3、 规律： 流式流式细胞细胞技术的技术的颜色颜色数量每九年翻倍数量每九年翻倍一次一次 通过图中可以看到，自 2000 年以后，随着紫激光的应用，流式 技术的色彩数量呈几何级增加，大大丰富了研究者的选择，提高了 流式技术对于科学研究的帮助，增加了研究的深度和广度。 市场上常见的可配备 405nm 紫激光的流式细胞仪： 二、二、 丰富的应用选择丰富的应用选择405nm 紫激光器的紫激光器的优势优势与应用与应用 紫色激光是流式技术由 6 色以下发展到 8 色和 10 色的关键激光， 其激发的紫色荧光素能够很好的与红色和蓝色激光共同使用，荧光信 号强，荧光干扰少，染料种类丰富。新型激光器的应用给科研工作
4、者 提供了更丰富的配色选择，大大提高了科研研究的深度和广度，为发 现新的成果奠定基础。 405nm 紫激光器与经典的红蓝色激光形成空间立体激发，大大 减弱彼此之间的干扰，从而更好的使得紫激光器匹配的染料与传统 的染料组合进行搭配，增加紫激光匹配的染料与应用范围： （1） 新型新型 Brilliant Violet 系列染料系列染料： BV421、BV510、BV605、BV650、BV711、BV786 系列染料具有荧光荧光 亮亮度度更高更高，荧光荧光补偿补偿更少更少，激发效率更稳定激发效率更稳定的特点，因而特别适合 于分辨弱表达弱表达细胞细胞群体群体。Brilliant Violet Dye
5、 与抗原低密度的标志物特 异性抗体偶联制成的流式荧光抗体，具有更高的分辨力，比传统 Pacific Blue染料亮度高 10 倍以上，适合肿瘤靶细胞的标记。 2000 年，诺贝尔化学奖被授予一种革命性的导电聚合物材料，该 聚合物染料光稳定性非常高，可以有效地收集激发光波并高效率将其 传递为更长波长的发射光，从而拥有更加优异的检测灵敏度。Brilliant Violet 系列染料就是基于诺贝尔化学奖原理而设计，具有明亮、不易 淬灭以及发射光谱窄等特点，大大丰富流式细胞技术在蓝紫波段染料 种类，拓展流式技术的应用范围。 VS BD Horizon Brilliant 是光学片段的聚合物链，聚合物链
6、中的每个链段都能够独立 吸收光子，因而可以具有非常大的消光系数（或吸收光子的概率）。独立链吸收光子 后，在电离子域的作用下，能量延链通过荧光共振能量偏转传送后发光，大大提高光信 号亮度和效率。 荧光荧光染料亮度分级表染料亮度分级表 Brilliant Violet 系列染料相对于传统染料具有更强的荧光信号以及 更好的稳定性，采用此系列流式抗体进行细胞染色鉴定时，将获得更 加优异的分辨能力，从而帮助科学家非常容易的寻找到感兴趣的细胞 群体。 BV421-CD4 FITC-CD4 BV421 PerCP-Cy5.5 （2） 细胞周期细胞周期、细胞倍性、细胞倍性、DNA 含量分析含量分析： 蓝色荧光
7、 Hoechst 系列染料为膜通透性染料，可以进入活细胞进行 染料，无需进行破膜、固定等处理，因而在研究中具有广泛的应用， 包括：RNA 存在条件下对 DNA 的高灵敏度检测（3ng），自动化 DNA 测定，准确的细胞计数，染色体分选等。并且，由于 Hoechst 染料对于 DNA 构象和染色质非常敏感，可以被用来进行 DNA 损伤的检测等实验。 Hoechst 染料在流式细胞术应用中通过监测染料的发射光谱位移进行测 量识别DNA损伤和其他生存力。Hoechst染料结合所有核酸，在富含AT 的 DNA 链上比富含 GC 的链上荧光信号增强 2 倍以上。 405nm 激光器结合 Hoechst
8、34580 等 DNA 染料，可以对活细胞的倍 性，细胞周期，活细胞内 DNA 含量情况进行更加精确的鉴定，更有实 际研究意义。同时，避免传统 DNA 染料，如 PI、7-AAD 等必须固定透 化后对死亡细胞的 DNA 研究，并且与 488nm 激光等搭配，可以研究细 胞代谢，细胞线粒体损伤，细胞吞噬等进行更加深入的研究。 如图，通过死活染料区分与不通过 死活染料区分，在鉴别细胞群体的 比例时会产生非常大的差异。图 中，研究 CD3+CD4+双阳性 T 细胞中 State5 的比例，左图采用细胞死活 染料进行区分，获取到 CD3+CD4+活 细胞中Stat5的比例在61%，右图未 区别死活，所
9、得 Stat5 的比例只有 40%，可以发现，如果将死细胞引入 到分析研究中，会对结果的准确性 产品较大影响，因而在流式细胞术 分析时是非常有必要进行细胞死活 区分的。 Hoechst34580 激发峰在 392nm 附近，因而采用 405nm 激光器激发效率在 60%以上，可 以有效激发 Hoechst34580 染料，同时该染料发射峰在 440nm 附件，采用经典的 450/40 通 道即可以对其进行接收，获取准确的信号。 （3） 细胞细胞群体群体活性与活性与细胞细胞因子、信号通路鉴定因子、信号通路鉴定： 流式细胞术在实际应用中，为了获取各细胞群体的准确比例，提 高实验结果的精确度，需要对
10、细胞群体的死活情况进行区分。如果不 考虑细胞死活的问题，往往会对后续实验结果的分析产生很大的影 响，导致实验结果的不可靠。 流式细胞术对细胞群体进行死活鉴定时，常用的传统染料有 PI、 7-AAD 等，原理是 PI 为细胞膜非通透性染料，并且 PI 可以对 DNA 进 行染色，活细胞细胞膜完整而死细胞细胞膜被破坏，因此死细胞会被 PI 染色而活细胞不会。然而采用 PI 或 7-AAD 进行死活鉴定时也有局 限性无法明确活性细胞群体的细胞因子以及信号通路表达情况。 为了克服 PI 等传统染料的局限性，BD 推出了新型的细胞死活鉴 定染料 BD Horizon Fixable Viability
11、Stain（FVS）系列染料。FVS 染料具 有如下特点： 1、不同于传统 PI 死活染料与 DNA 的反应，FVS 染料采用新型的胺 反应，同时也是细胞膜非通透性染料； 2、传统 PI 染料是无法标记固定和透化过的细胞，FVS 染料标记的细 胞可以是固定的和透化过的，使得染料与多种下游应用兼容，增大了 死活鉴定的应用范围也提高了下游应用结果的准确性； 3、FVS 染料可以在固定的细胞中保持过夜，也可以在低温条件下保 持反应活力； 4、FVS 系列染料提供八种不同的可固定活力染色试剂，使用过程中 拥有更多的选择以及更多的颜色搭配。 不同样品中 FVS 染料与 7-AAD 染料细胞活力染色结果的
12、相关性。样品采用制备的细胞与 长期体外培养的细胞系各自研究中呈线性关系，在鉴别死活的能力上，FVS 染料与 PI 等 传统染料的结果相一致。 FVS450 染料采用 405nm 紫激光器激发，最大发射峰在 450nm。通过配置有 405nm 激光器的流式细胞仪来进行细胞活力鉴定，可以解放出 FITC、PE、PerCP 等通道，使得流式多色实验中优 化出更多更好的配色方案 。细胞使用 FVS450 活力染料染色，后续可 以用甲醛固定后进行透化来检测细胞内抗原的实验方案。FVS450 染 料也可以应用于采用甲醇或透化剂的胞内染色。 Examples of multicolor flow cytom
13、etric analysis of Phosphorylated Stat3 and Stat5 expression by “viable” activated PBMCs 胞内细胞因子以及磷酸化检测时，是否进行死活区分对结果的影 响是非常大的，如果需要获取到更加准确的结果，必须细胞死活情况 进行区分，获取到活细胞的表达情况，从而更有实际研究意义。在这 一点上，传统的 PI 染料是无法办到的，PI 染色死细胞后仍会部分游 离，后续在破膜处理时会进入到之前的活细胞中，从而影响到检测结 果。但是采用 FVS450 染料，由于其与细胞进行胺反应形成稳定的状 态，是一种不可逆性的结合，从而后续处理对
14、于之前细胞活力的染色 不会形成干扰，最后检测时可以得到准确的活细胞中细胞因子的比 例。 Reference 1. De Rosa, Stephen C., Jason M. Brenchley, and Mario Roederer. “Beyond six colors: a new era in flow cytometry.“ Nature medicine 9.1 (2003): 112-117. 2. Ormo, Mats, et al. “Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein.“ S
15、cience 273.5280 (1996): 1392. 3. Prendergast FG, Mann KG; Mann. Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forsklea. Biochemistry 17.17 (1978): 3448-3453. 4. Tsien RY. The green fluorescent protein. Annual review of biochemistry 67.1 (1998):
16、 509-544. 5. Phillips G. Green fluorescent protein-a bright idea for the study of bacterial protein localization. FEMS microbiology letters 204.1 (2001): 9-18. 6. Shimomura O, Johnson F, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. Journal of cellular and comparative physiology 59.3 (1962): 223-239. 7. Shaner, Nathan C., Paul A. Steinbach, and Roger Y. Tsien. “A guide to choosing fl
