发酵过程优化与控制技术研究

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1、发酵过程优化与控制技术研究堵国成 江南大学 1生物质原料化学品 精细化学品 大宗化学品 食品添加剂 生物塑料 溶剂 酚类 粘合剂 脂肪酸 碳黑、颜料 燃料、香料、墨水 洗涤剂生物能源生物酒精生物柴油甲醇氢气沼气工业生物技术主要部分-发酵工程2获得应用价值的微生物反应器及过程放大发酵过程优化和控制发酵工程研究发酵产物分离提取3发酵工程的关键问题和工程意义微生物能够积累最大目的产物 (产量)的条件是什么？高产量 便于产品分离 提取关键问题1工程意义1相关研究：微生物生理、遗传特性和营养、环境因素4底物最多被微生物转化为产物 (转化率)的条件是什么？粮食原料为底物 高转化率 降低原料成本关键问题2工

2、程意义2相关研究：微生物代谢途径和过程条件发酵工程的关键问题和工程意义5微生物最快速度发酵生产目的 产物的条件是什么？分批操作为主 高生产强度 缩短生产周期工程意义3关键问题3相关：微生物反应动力学和系统优化发酵工程的关键问题和工程意义6条件 确定过程 优化初始 条件过程 分析过程 强化发酵优化的研究思想：发酵是一个过程7基于细胞表观特性进行优化0 4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L) A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h r (Glucose) / (g/L) B 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70

3、 80t / h r (Pyruvate) / (g/L) C 基于细胞内部分析进行优化高产量高底 物转 化率高生 产强 度优化策略在理论和技术上有突破，在工业生产中能广泛应用 显著提高发酵过程的经济性和科学性研究方法81 基于微生物反应原理的培养环境优化技术基于微生物反应原理的培养环境优化技术优化微生物生长的物理和化学环境 保证微生物生长处于最适条件基本思想奠定基础基于底物运输、生化反应、产物排出确定不同环境条件对微生物生长 和代谢产物分布的影响Prod. Distribution发酵优 化技术9培养基组成的优化技术 发酵环境条件的优化技术确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足 减少

4、副产物的形成，使底物转化率明显提高 对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物 产量明显提高 分析不同环境条件下微生物的生理学目的内容102 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术研究思想研究思想控制环境条件在最适合细胞生长或最适 合产物合成的水平目 的分 析不同T、pH 、RPM、 DO发酵过程的动力学参数(， qp，qs) 流变学参数的变化特性分阶段控制策略提 出分阶段T、 pH、RPM、 DO发酵优 化技术113 基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术研究思想研究思想建立动力学模型，求解参 数并评价其适用性对发酵进程和产量 指标进行预测ModelFormMonod Constant

5、yieldu = umax s/(K m + s) Y x/s = Y0Substrate inhibition Constant yieldu = umax s/(Km + s + s2/Ki) Y x/s = Y0Substrate inhibition Variable yieldu = umax s (1 - T. s)/(K m + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 (1 - T. s)/(1 + R. s + G. s2) Substrate and product inhibition Inhibitions Constants yieldsu = umax s/(Km

6、 + s + s2/Ki) u = umax o (1 - P/P m ) q p = alpha. u+ beta alpha, beta and Y p/s以数学模型为基础的优化优化发酵过程发酵优 化技术12以生理模型为基础的优化采用人工神经网络、专家系 统、模糊逻辑控制技术对发酵过程 进行在线状 态预测和模 式识别自适应最优 化控制系统 的开发、计 算机模拟和 实际应用134 基于代谢通量分析的过程优化技术基于代谢通量分析的过程优化技术研究思想研究思想参考已知的生化反应计量关系、 代谢途径、生理、特征，构建、 合成不同产物的代谢网络。利用代谢通量分析方法，计算得 出胞内各条代谢途径的通量

7、变化 。发酵优 化技术14分析不同发酵产品合成途径中主要代谢节点的性质，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，提出一系列发酵优化策略。 目的目的15长期胁迫可遗传性的应答（ 遗传变异） 短期胁迫不可遗传性的应答 （生理性的)PyruvateNAD+NADHADPATPethanolAnaerobicAerobicMitochondrionATP环境压力或胁迫饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱 、高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的 激活以及代谢途径的临时调整等5 基于环境胁迫条件下微生物生理应答的过程 优化技术发酵优 化技术16研究一些重要

8、的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫 机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代 谢途径变化，采用不同环境胁迫手段或措施对微生物 的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成 目的产物。 学术思想17学术思想6 基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术CofactorsMetal ionsNADH/NAD+NADPH/NADP+ATP/ADP/AMPCoA/Acetyl-CoAVitamins研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制 代谢流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规 律，对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物合成目的产物 的代谢流的最大化和快速化。 发

9、酵优 化技术18发酵过程优化与控制技术研究举例19举例1：丙酮酸发酵GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH (B1, NA)PDC (B1) PT (B6) PC (Bio) B1： 硫胺素 NA： 烟酸 Bio：生物素 B6： 吡哆醛GlucosePyruvate光滑球拟酵光滑球拟酵 母中丙酮酸母中丙酮酸 代谢途径代谢途径如何得到丙酮酸高产量发酵？-菌株选育和培养条件优化XXXX选育自身不能合成维生素的酵母(维生素缺陷型) 控制培养基中维生素浓度 20t 0.4 0.8 1.2 1.6

10、 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F qp/ h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h-11 2 3 -1D 动力学分析高溶氧下，丙酮酸转 化率较高，但生产强 度(葡萄糖消耗速度)较 低 低溶氧下，葡萄糖消 耗速度加快，然而丙 酮酸产率却明显下降代谢网络分析 DO=10%DO=85%PEP到Pyr的通量增加 了20%，丙酮酸进一 步代谢的通量下降了 63.3%高溶氧下转化率 高的原因如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？-分阶段溶氧控制辅因子分析总ATP下降31.4%, NA

11、DH下降18.6%生产强度 (葡萄糖消耗速度)59低溶氧生产强度高 的原因DO=10%DO=85%21高产量(89.4 g/L) 高产率(0.636 g/g) 高生产强度(1.95 g/(Lh) 确定分阶段供氧模式:发酵 0-16 h控制kLa为450 h-1， 16 h后将kLa降低至200 h-1碳平衡分析前16 h较高溶氧有利于碳 流合成细胞；采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！16 h后耗氧速率恒定，碳 流转向合成丙酮酸结果如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?-分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制！如何分阶段？22举例2：维生素C发酵微生物的功能优化与调控我国是世界最大

12、的维生素C生产国和出口国，2009年生产10万吨 左右，产值45亿，占世界市场90 小菌(氧化葡萄糖 杆菌G. oxydans )大菌(巨大芽孢杆 菌B. megaterium )关键科学问题：维生素C发酵微生物的功能关系L-山梨糖2-酮酮基-L-古龙龙酸现况：维生素C两步发酵工艺 小菌单独培养生长、产酸困难 大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸团队承担的国家863重 点项目和国家支撑项目与南开大学功能基因组 学中心、国内最大Vc生 产企业合作实现组学技术解决发酵 工业长期问题的典型+23基因组测序步骤鸟枪法测序提取基因 组DNA打断基因 组DNA基因文 库构建大规模 测序罗氏GSFLX高通量基

13、因组测序 衔接子 连接单链DNA与 磁珠结合油滴中 PCR反应序列拼接测序 反应填补缺口基因组注释代谢途径分析小菌测序大菌测序代谢途径分析代谢途径分析从代谢 途径角 度解析 两菌关 系24氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因， 柠檬酸循环不完全无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶 ，不能通过糖异生生产C6G.oxydans基因组含编码氧化戊糖磷酸 途径和D途径的全部酶基因缺失编码磷酸 果糖激酶的基 因，糖酵解途 径不完全25蛋白质组学小菌单独发酵时 胞内蛋白表达大菌存在时小菌 胞内蛋白表达功能蛋白确定， 研究大菌影响小 菌产酸的机制K. VulgarB. megaterium2

14、6发酵 优化明确大菌调控小菌的作用方式明确大菌调控小菌的作用方式阐释大小菌之间的功能关系阐释大小菌之间的功能关系发展调控小菌生理功能的策略发展调控小菌生理功能的策略提高糖酸转化率提高VC产量提高生产强度基因 测序功能 蛋白产物 解析3-磷酸 甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循环大菌特定的代谢途径L-山梨酮2-酮基-L-古龙酸L-山梨糖2-酮基-L-古龙酸生产途径 Vc目标1：确定微生物之间的功能关系，提高效能目标2：构建Vc一步发酵菌株，实现重大创新举例2：维生素C发酵微生物的功能优化与调控27举例3：透明质酸(HA)发酵过程优化与控制透明质酸三级结构优良理化性质：粘弹性 高保湿性 生物相容性 食品添

15、加剂关节炎治疗化妆美容高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈乳酸对细胞生长和HA合成有着较强的抑制作用细胞生长和HA合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争HA发 酵存在 问题28透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究问题高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈溶氧水平表观黏度有效搅拌区域模型有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学(Va=1）剪切力对菌体形态影响理想HA发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧溶氧水平溶氧传递系数表观粘度搅拌转速29降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率问题高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈氧化还原降解HA提高混合与传质效率FT-IR分析结果过

16、氧化氢/抗坏血酸氧化还原降解HA氧化还原 降解HA没 有破坏其 基本结构 单元HA氧化还原降解对HA发酵的影响添加H2O2/抗坏血酸对流体力学影响添加H2O2,Vc30Transglutaminase (TGase, Protein glutamine - glutamyltransferase, EC 2.3.2.13 )举例4： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 通过 N-(-谷酰胺) 赖氨酸键交联蛋白质 催化蛋白质中Gln的-羧酰胺基与伯胺间发 生转移反应 蛋白质脱酰胺作用 通过形成脂键共价连接蛋白质和脂肪酸的长 链-羟基 目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质 间形成共价交联的酶制剂31Ac