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1、色谱分析之：液相色谱沈晓芳高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。一、概述 Generalization液相色谱仪( (一一) )、HPLCHPLC与经典与经典LCLC区别区别经典液相色谱高效液相色谱 常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一 次 不能在线检测高压，4050MPa填料颗粒小，2 50m 柱效高,40000 60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次 使用 能在线检测( (
2、二二) )、HPLCHPLC与与GCGC异同点异同点气相色谱高效液相色谱 只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器（FID和TCD） 流动相为气体，无毒，易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小 几乎可以分析各种物质 可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很 高 没有较高灵敏的通用检测器 流动相有毒，费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大 近来出现的蒸发激光光散射检测器（ELSD）是灵敏度较高的通用检测器流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作
3、用力，只与固定相作用。 HPLC：流动相为液体 组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性 操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）流程及主要部件三、高效液相色谱法的特点和应用特点： “ “三高三高” “” “一快一快” “” “一广一广” ” 高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度(紫外：10-9g；荧光：10-11g) 高选择性 分析速度快(1h) 应用范围广
4、泛（可分析80%有机化合物） （是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）1 按固定相的聚集状态可分为： 液液色谱法(LLC) 液固色谱法(LSC) 2 按分离机制可分为： 分配色谱法 吸附色谱法 化学键合相色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 亲和色谱法高效液相色谱的分类四、流程及主要部件process and main assembly of HPLC 1.流程液相色谱流程图PUMPDetectorWData station (Recorder)or Collection2.主要部件 (1) 高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小
5、的固定相（ 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳 环己烷己烷煤油(最小)4. 选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损 坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。选择高效液相中溶剂的示意图 一、影响分离的因素fac
6、tors influenced separation1. 影响分离的因素与提高柱效的途径在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分 之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不 计， 根据Van Deemter方程，板高H ：u 为流动相线速度；A分别表示涡流扩散系数；B分子扩散系数；C传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。H = A + C u故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程， 降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。 改变淋洗液
7、组成、极性是改善分离的最直接的因素。2.流速流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降 低流速，柱效提高不是很大。但 在实际操作中，流量是一个调整 分离度和出峰时间的重要参数。3.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。速率方程可简化为：Dm、Ds试样分子在流动相、固定液中的扩散系数 关键是将H变小，而H变小关键是使为填料粒径 dp变 小，固定液液膜厚度 df变小。因此采用35m 固定相颗 粒，且键合相层薄，因此df就小，由于H很小，n很多，R 大改进
8、，实现了高效。在分离良好的基础上，才可提高流动相线速，节省了 分析时间，从而实现了高速分离。如何实现高速分离？影响色谱峰扩展的因素二、分离类型选择choice of separation types理想的理想的HPLCHPLC检测器应具有如下特性：检测器应具有如下特性：第一，具有高灵敏度；第一，具有高灵敏度； 第二，对样品所有组分都有响应，适用范围广；第二，对样品所有组分都有响应，适用范围广； 第三，温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响；第三，温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响； 第四，响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱；第四，响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱； 第五，死体积小，不
9、造成柱外谱带扩展；第五，死体积小，不造成柱外谱带扩展； 第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修；第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修；第七，响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽；第七，响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽； 第八，不破坏样品组分；第八，不破坏样品组分； 第九，能对被检测的峰提供定性和定量信息；第九，能对被检测的峰提供定性和定量信息； 第十，响应时间快。第十，响应时间快。 5 液相色谱检测器分类标准种类响应原理特点常用类型按检测 器性质 或应用 范围分 类总体性能 检测器响应值取决于流出物（包括 样品和流动相）某些物理性 质的总的变化的检测器有广泛的适用
10、范围 ，基线噪音和漂移 较大，灵敏度低， 不适于痕量分析， 不能用于梯度洗脱示差折光率检测 器 介电常数检测器 电导检测器溶质性能 检测器响应值取决于流动相中溶质 的物理或化学特性的检测器检测灵敏度高，受 操作条件和外界环 境影响小，可用于 梯度洗脱，应用范 围受限制紫外-可见检测器 荧光检测器 化学发光检测器 安培检测器 手性检测器 按测量 信号性 质分浓度敏感 性检测器响应值正比于溶质在流动相 中的浓度，测量的是流动相 中溶质浓度瞬间的变化样品量一定时，检 测器瞬间响应即峰 高响应值和流动相 流速无关，峰面积 与流速成反比，峰 面积与流速乘积为 常数大部分常用的液 相色谱检测器都 属于该类
11、检测器质量敏感 性检测器响应值正比于单位时间内通 过检测器的物质的质量即正 比于质量流速峰面积与流动相流 速无关，峰响应值 与流速成正比库仑检测器检测器的分类 ：按 测 量 原 理 分光学性质 检测器根据被测物质对光的吸收、 发射和散射等性质进行检测 的应用范围广，灵敏 度高紫外-可见检测器 ，示差折光率检 测器，蒸发光散 射检测器，荧光 检测器，化学发 光检测器，手性 检测器 电学及电 化学性质 检测器根据被测物电化学性质进行 检测安培检测器，电 导检测器，库仑 检测器，介电常 数检测器，极谱 检测器热学性质 检测器利用热学原理进行检测 光声检测器，热 透镜和光热偏转 检测器按信号 记录方
12、式分积分型检 测器显示的信号是指在给定时间 内物质通过检测器的总量灵敏度低，定性困 难，应用少微分型检 测器显示的信号表示在给定时间 内每一瞬间时通过检测器的 量灵敏度高 紫外检测器特点：应用最广，对大部分有机化合物有响应。灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。B. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器示差折光效应示差折光检测器 Differential Refractive Index
13、 Detectorc. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；优点：通用型检测器（每种物质具有不同 的折光指数）；缺点：灵敏度低、对温度敏感、不能用于 梯度洗脱；分类：偏转式、反射式和干涉型三种；示差折光检测器荧光检测器荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象 。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外 线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立 即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）； 荧
14、光：从激发态分子衰变为自旋多重度相同的基态 或低激发态时的自发发射现象。 荧光检测器荧光检测器特点： （fluorescence detector）高灵敏度； 高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物 等有响应；缺点：应用范围有限电化学检测器安培检测器：随着化合物被氧化或还原，产 生正比于浓度的电流电导检测器 Conductivity Detector制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径2050mm，柱长50cm。半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；四、制备型
15、液相色谱preparative liquid chromatography1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2. 液相制备色谱的方法收集组分时：（1）主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分 成为主成分（富集）后，再次分 离制备。 一、超临界流体色谱的特点与原理 feature and principle of SFC 二、超临界流体色谱仪的结构流程 structure and general process of SFC 三、超临界流体色谱的应用 application of SFC五 超临界色谱Supercritical fluid chromatograph, SFC一、超临界流体色谱的特点与原理 Principle and character of supercritical fluid chromatography1.概述超临界流体：温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临 界流体(Supercritical fluid)。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SCF)具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸
