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1、流 式 细 胞 仪 补 偿 设 置 众所周知 流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料 通过荧光将 488nm 或其他波长的光转变为另一波长的光 并通过光电倍增管将光信号转变为电信号 并由计算 机统计处理变为可读数据 现在流式细胞上常用的荧光素有 激发波长 发射波长 FITC 488nm 525nm PE 488nm 575nm PE-TR 488nm 615nm PE-Cy5.5 488nm 667nm PE-Cy7 488nm 767nm 以上五种荧光染料可在 Coulter XL 或 BD Calibur 或 Partec,PAS,CyflowCytomation,Moflo 机
2、型上使用 APC 633nm 660nm APC-Cy 633nm 767nm (以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用如 Coulter,Altra 或 BD Calibur 或 Partec Cyflow ML 或 Cytomation, Moflow) 以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值 但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态 或偏态曲线即有很宽的范围如下图为 FTICPE 的发射波长可以看到两者的发射波 长均为偏态分布 FITC受激后多数将光源转变为525nm左右的光 PE多数将其转变为575nm 左右的光 故在流式细胞仪中对 FITC 检测 525nm 附近的光 对 PE
3、则检测 575nm 左右的光 如果此时同时使用两种荧光染料就会出现发射光谱相互叠加的现象 根据上图中 FITC 和 PE 发射波长的叠加情况在流式细胞仪检测光信号时PE 荧光探测器 便会误检由 FITC 发射的 575 左右波长的光此时计算机会将此部分信号计入 PE 荧光信号 中从而引起错误同样 PE 受激后也会发出小部分 525nm 左右的光进入 FITC 荧光探测 器中此时就需要进行一系列仪器设置人为地去除该部分干扰下图为其他荧光素发射波 长之间相互叠加情况 生 物 秀现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的 FITCPE 等荧光分子性状十分相近其发射光的 光谱分布也十分稳定 通过一系列调节
4、可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探测器 信号的百分比 一但设定该值 计算机会在其他探测器中减去根据的本探测器的信号乘以百 分比后的数值如下图 其他荧光的补偿调节原理也同上图如做 FITCPEPE-Cy5 三色荧光分析原则上需要调节的补偿有FITC-%PEPE-%FITCPE-Cy5-%FITCPE-Cy5-%PEFITC-% PE-Cy5 PE-% PE-Cy5 六组补偿即有 23种组合 由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理所以 525nm 或其他波长的光信号 可被转化为任何强度的电信号 同时又因为补偿电路在放大电路的后面 故补偿过程中的百 分比数值将由两个部分决定 原荧光探测器
5、的信号与漏进其他探测器的信号 补偿最终要达 到的效果是 漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号 x N%=0 由此补偿的百分比数值 将随着各灾光探测器的放大倍数电压变化而变化特定电压对应于特定的补偿参数 要确定补偿中百分比数值需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现 如现进行 FITCPE 双色分析先准备该试剂的阴性对照管 AIgGFITC/IgGPE通过调节电压使阴性群体落在 FTIC 及 PE 双阴性区注在进行调补偿时必须将原补偿全部归零 阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数 即归零 荧光阴性对照实 际为没有特异性的与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白由于化学键生
6、物键及分子之 间的吸引作用这些蛋白会与标本中的细胞结合在流式细胞仪上可检出一定的信号当荧 光特异性抗体与标本结合时会产生两部分信号非特异信号即同阴性对照的信号和 特异性结合信号 所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其 归入统计范围 B FITC 标记抗体/IgGPE 上图为未调补偿的双参数直方图如在理想情况下没有荧光干扰因为检测管中只联科生物技术有限公司 流式细胞仪补偿设置 - 4 - 含有 PE 标记的 IgG 阴性对照如同 A 管一样所以仍将没有何任信号出现但实际情况 并不如此 在 PE 坐标上出现了阳性信号 这个信号就是由于 FITC 荧光漏入 PE 探测器中而
7、 引起的此时就要取一合适百分比与 FITC 信号相乘后去抵消 PE 中的信号此时电压已通过阴性对照设定绝对不可变动 通过调节补偿参数Coulter 机器是实时调节系统可通过 FastComp直观形象地可 将 PE 的信号降低BD 机器则无法做到只能通过数字直接调节补偿百分比如下图 打个比方 通过 A 管已将 FITCPE 的荧光信号设为零 此时检测 FITC 标记抗体与 PE 阴性对照FITC 信号假设为 1000漏入 PE 的信号为 200在补偿调节 1 号位时补偿数字 为 5%通过计算得出 PE 信号200-1000x5%=150此时 1 号位的补偿不足同理 2 号位的 补为 15%此时
8、PE 信号为200-1000x15%=50补偿仍显不足3 号位的补偿为 20%PE 信号为 200-1000x20%=0 补偿调节良好 4 号位补偿为 30% PE 信号为 200-1000x30%=-10 此时补偿调节过头PE 的信号会比原来的本底还低补偿调节不足或过头都会造成不准确 的结果所以要避免以上两种情况的出现 当将FITC漏入PE的信号恰好全部减除时即PE信号与原来本底相同时此时的补偿便时正确的即FITC单阳性细胞的PE的平均荧光强度与双阴性细胞PE荧光强度一至 对于 FITC 阳性细胞通过调节补偿需将 PE 中的信号恢复至与其本底一至由上图可 知调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的
9、情况即通过 A 管调节电压确定阴性范围其 次在检测 FITC 标记管中必须存在阳性细胞和阴性细胞只有这样才能有本底参照将 PE 的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿 同理如检测 C 管FITC 阴性对照/PE 标记抗体可将 PE 漏入 FITC 中荧光去除但前提条件是在C管中要存在FITC/PE双阴性细胞和PE单阳性细胞 在流式细胞上当PE单阳性细胞的FITC平均荧光强度与双阴性细胞的FITC平均荧 光强度一至时补偿便调节完毕 在做多色分析时必须做荧之间的补偿方法如上先准备各种标记的荧光阴性对照调节确定合适的放大电压逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照然后调节特异性荧光对
10、每个荧光的补偿 在日常工作中我们可以用 CD4/CD8或 CD3/CD4/CD8 多色抗体来调节荧光补偿现 将其原理及方法解释如下 在人外周血中存在有 TBNK 等白细胞当加入 CD3PE-Cy5/CD4FITC/CD8PE 三 色荧光抗体时会出以下几种情况 CD3-/CD4-/CD8-细胞群如 B细胞 CD3+/CD4-/CD8-细胞群如 NK 细胞 CD3+/CD4+/CD8-细胞群如辅助型 T 细胞 CD3+/CD4-/CD8+细胞群如杀伤型 T 细胞 由上可知无论对于哪一个荧光参数都存在阴性细胞群及单阳性细胞群这就满足了调 节补偿的基本要求已知不存在 CD3-/CD4+和 CD3-/C
11、D8+阳性细胞又已知 PE-Cy5 对于 PE 和 FITC 的干扰很小所以不用考虑 CD3PE-Cy5 荧光对 CD4FITCCD8PE 荧光的干扰 不会有假阳性存在补偿调节如下 在许多实验中 会用到某一标记物进行设门情况 此时最终观察的单参数结果而非双参 数所以往往会忽略其中补偿的问题在这种情况下调节补偿的方法又略有不同但万变不 离其宗只要清楚地理解补偿的形成及调节原理便能解决问题详细的方法见有关章节涉 及设门的实验方案 生生物物秀秀- -专专心心做做生生物物 生物秀论坛学术交流、资源共享与互助社区 http:/ 生物部落生物医药人网络家园 http:/ H 生物百科生命科学第一百科 http:/ B 生物秀知道生命科学问题解决之道！ http:/ A 易生物-领先的生物医药商务平台
