《骨髓间充质干细胞移植修复溃疡性结肠炎的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓间充质干细胞移植修复溃疡性结肠炎的实验研究（68页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学硕士研究生学位论文英文缩写英文全称符号说明M S C sm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s中文全称间充质干细胞B M S C sb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s骨髓间充质干细胞U CT N B SH C TF B SF I T CP EE D T AM T rF C ME G FS PD M S OH EP B SP F AD M E M F l2D A Bu l c e r a t i v ec o l i t i s溃疡性结肠炎2 4 6 - t f i n i
2、 t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d2 , 4 ，昏三硝基苯磺酸H o e c h s t3 3 3 4 2f e t a lb o v i n es e r u mf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t eP h y c o e r y t h r i n烟酸己可碱3 3 3 4 2胎牛血清异硫氰酸荧光素藻红蛋白E t h l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d乙二胺四乙酸竺耋曼：竺l m y l 粤警。1 z ) r 1
3、) 2 ，5 - d i p h e n y l二甲基噻唑二苯基四氮唑溴盐t e l 【n 1 2 D 1 1 啪b r o m i d eF l o wc y t o m e t e rE p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rS t r e p t a v i d i n - p e r o x i d a s eD i m e t h y l es u l f o x i d eH e m a t o x y l i na n dE o s i nP h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n eP a r a f
4、o r m a l d e h y d eD u l b e c c o sm o d i f i e dE a g l e Sm e d i u m F12 H a m s3 , 3 一d i a m i n o b e n z i d i n e流式细胞仪表皮生长因子过氧化物酶标记链霉卵白素二甲基亚砜苏木素伊红磷酸盐缓冲液多聚甲醛D u l b e c c o S 改良培养基3 , 3 一二氨基联苯胺重庆医科大学硕士研究生学位论文T N F aI L 1 0T u m o rn e c r o s i sf a c t o rQI n t e r l e u k i n10m i n h
5、d wm i n u t e h o u r d a y w e e k肿瘤坏死因子a白介素l O分钟d , 时天周n g p g m gn a n o g r a m m i c r o g r a m m i l l i g r a m纳克微克毫克印ml a l m lI O DA I O Dr o u n d sp e rm i n u t em i c r o l i t e r m i l l i l i t e ri n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t y每分钟转速微升毫升积分光密度a r e ai n t e g r a t e d
6、o p t i c a ld e n s i t y面积积分光密度2重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任学位论文作者签名：塑丝日期：丝墨乏笸学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作
7、的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文论文作者签名：指导教师签名：日期：重庆医科大学硕士研究生学位论文骨髓间充质干细胞移植修复溃疡性结肠炎的实验研究摘要目的骨髓间充质干细胞( B o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，B M S C s ) 具有高度增殖、自我更新能力，可向三个胚层的细胞分化【
8、，在机体组织损伤修复过程及细胞移植治疗等多个领域有广阔的应用前景。目前已有干细胞移植成功治疗炎症性肠病的报道 2 1 ，但其在消化道分布定位情况及治疗机制仍不明确。本实验拟制作、比较大鼠溃疡性结肠炎( u l c e r a t i v ec o l i t i s ，U C ) 模型；分离、培养、扩增、荧光标记大鼠B M S C s ，观察其生物学特性：观察标记的同种异体B M S C s经静脉移植后不同时间在U C 及正常大鼠主要器官、消化道各段的分布情况：结肠内B M S C s 是否明显多于消化道其余各段? 溃疡病灶处B M S C s 是否明显多于非溃疡部位? 移植B M S C s
9、 后是否结肠病变修复优于非移植组? E G F 能否促进B M S C s 向溃疡部位迁移? 为B M S C s 在消化管组织工程以及肠黏膜损伤性疾病治疗研究中的应用，提供基础理论和实验依据。第一部分溃疡性结肠炎大鼠模型的建立与比较1 材料与方法S D 大鼠6 4 只，随机分为：I 组( 免疫+ T N B S 乙醇) 和I I 组( T N B S 乙醇) 各2 4 只，I 组( 乙醇) 1 2 只，组( 生理盐水) 4 只。参照文献制作模型，于造模后第l 、2 1 天，第8 周、1 2 周处死大鼠，剖取全重庆医科大学硕士研究生学位论文部结肠及回肠末段观察：大体形态及结肠黏膜损伤情况；光镜
10、下结肠黏膜损伤；免疫组化检测不同模型组肠壁组织表达T N F Q 和I L 1 0 的情况。2 结果2 1 肉眼及光镜显示：I 、I I 组均出现糜烂、溃疡等典型U C 结肠病变，I 组还伴有末段回肠病变；I 组的病变可维持8 周，I I 组病变3周后趋向愈合。I 组病变仅黏膜充血水肿和少量糜烂或浅表溃疡，第2 l 天痊愈。组未见组织损伤。2 2 免疫组织化学染色结果经图象分析显示：成模期内I 、I I 、I 组结肠黏膜T N F Q 表达高于正常对照的组，I L 1 0 低于正常对照的组，差异均有统计学意义( P 3 d 1 4 d ，骨髓的荧光I O D7 d 1 4 d 3 d ；第3
11、、7 d 肺的荧光I O D 值和第1 4 d 时骨髓的荧光I O D 值略高于其他器官；同一器官同一时间点各组荧光I O D 值的差异无统计学意义。2 2 移植第3 、7 、1 4 d ，B 、C 和D 组食道、胃及小肠的黏膜层均可见标记的B M S C s ，同一器官同一时间点各组荧光I O D 值的差异无统计学意义。2 3 移植第3 d ，各组结肠与同组食管、胃及小肠荧光I O D 值的差异无统计学意义；移植第7 、1 4 d ，B 、C 组结肠的荧光I O D 值高于同组食道、胃及小肠( P 3 d 1 4 d ；t h eI O Dl e v e lo f B M S C si nb
12、 o n em a r r o ww a s7 d 1 4 d 3 d A td a y7 ，t h eh i g h e s tI O Do fB M S C sw a si nl u n gi na l lo r g a n s ，a n da td a y14 ，t h eh i g h e s to n ew a si nb o n em a r r o w ( P ( 1 0 601 2 3 荧光检测以及细胞计数收集B 、C 、D 组新鲜骨髓、肺、肝、脾以及结肠组织的一部分，2 5 明胶包被后制作恒冷箱冰冻组织切片( 厚5um ) ，风干后甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照。同时，用I
13、 P P 软件观测计算每组1 0 个随机2 0 倍视野下H C T 荧光标记细胞的荧光阳性积分光密度值( I O D ) 。随后用7 0 酒精洗去切片上的甘油，重新进行H E 染色、封片后，普通光学显微镜下观察拍照。1 2 4 免疫组织化学染色将A 、B 、C 、D 组肠壁标本的石蜡块做成5 l am 连续切片，常规脱蜡至水。按第一部分的免疫组织化学染色和图像分析方法，用A I O D 值显示各组肠壁组织表达4 1重庆医科大学硕士研究生学位论文T N F - Q 及I L - 1 0 的变化。1 2 5 统计学处理用S P S S l 2 0 统计软件对实验数据进行分析。计量资料均以x S 表
14、示，组间比较用方差分析，组内比较选用N e w m a n s t u d e n t K e u l 检验。2 结果2 1 病理形态A 、B 和C 组结肠巨体标本见全结肠性炎症及溃疡，黏膜皆出现充血、水肿、糜烂以及溃疡，溃疡2 3 个，直径约3 - - 一5 m m 。光镜下可见溃疡及炎性渗出物，上皮细胞坏死脱落，黏膜下层及浆膜层广泛严重的充血、水肿、大量炎症细胞浸润，局部坏死深达肌层。移植后第1 4 天，B 和C 组结肠黏膜病变修复程度明显优于A 组，黏膜糜烂、坏死灶较小而少，肌层己无坏死；D 组大鼠结肠黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则，黏膜、固有层血管纤维间质正常，肌层无异常。( 图I
15、一4 ，6 ，8 ，1 0 ，1 2 ，1 4 )2 2 荧光显微镜观察2 2 I 骨髓、肺、肝以及脾荧光观察B 、C 和D 组的骨髓、肺、肝、脾冰冻切片上均可见H C T 荧光标记细胞，细胞核发明亮蓝色荧光，常多个细胞呈团状分布( 图I 1 2 ) 。H C T 标记细胞在各器官分布数量有一定时间规律性：肺、肝、脾荧光1 0 D 值7 d 3 d 1 4 d ，骨髓的荧光1 0 D 值7 d 1 4 d 3 d 。第3 、7 d 肺的荧光I O D 值和第1 4 d 骨髓的荧光I O D 值略高于其他器官。各组同一器官同一时间点荧光1 0 D 值的差异也无统计学意义( 表I I I1 1 )
16、 。表1 1B M S C s 移植鼠不同时间点各器官荧光I O D 值( n - 5 ，x - e s )T a b l e ml - lI O Di nt h eo r g a n so fr a t sw i t hB M S C st r a n s p l a n t a t i o n ( n = 5 ，x 士s )T i m ea f t e rt r a n s p l a n t a t i o no r g a ng r o u p 3 d7 d1 4 dB o n em a r r o wB1 1 2 4 8 2 0 2 l1 3 7 9 8 7 8 71 3 1 9 6 1 0 2 44 2重庆医科大学硕士研究生学位论文C1 1 0 8 4 l l l 21 3 5 0 5 1 0 1 61 3 0 7 9 2 0 4 7D1 1 2
