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1、中国化工学会（IESC）2006 年年会 中国化工学会（IESC）2006 年年会 371预吸附法阻抗材料表面蛋白吸附的研究进展 陶蕊，陈晓农*，夏宇正，石淑先 （北京化工大学材料科学与工程学院，北京，100029） 摘摘 要：要：阻抗非特异性蛋白吸附的性能是材料具备生物相容性的重要条件。本文主要介绍预吸附法改善材料抗蛋白吸附性能的研究现状和预吸附及蛋白吸附的表征方法。 关键词：生物相容性，阻抗蛋白吸附，表面预吸附，研究进展 *通讯联系人，Email： 1前言前言 生物相容性问题是生物材料研究所要解决的首要问题， 而生物材料表面的非特异性蛋白吸附是造成生物相容性不理想的主要原因。 在实际应用中
2、， 生物材料或制件表面的非特异性蛋白吸附会诱发体内的生物排异反应1，血栓形成，细菌繁殖与感染等严重的问题2。此外，在非体内应用场合，非特异性蛋白吸附也有诸多危害，如诱发海洋生物附着船体，增大航行阻力；生化分离膜的生物垢堵塞、换热器生物结垢；在生化分析检测中导致感应探头失准、失效等3。 在分子水平，血栓、生物垢等形成的开始阶段有着共同点，那便是蛋白迅速的吸附在无保护的材料表面4-5。因此，材料表面抗蛋白吸附的研究是医用材料、生化分析、生物化工、海洋防污等领域的重要课题。 为改善合成材料表面对蛋白吸附的阻抗性能， 提高材料表面的亲水性是基本途径。 传统方法是将合成材料与亲水聚合物共混或在材料表面接
3、枝亲水聚合物。共混法中，混合尺度及相态结构不易控制，常导致材料本体物理机械性能劣化。 当亲水聚合物与基体材料相容性差时， 在使用环境下难以克服亲水相的溶解。接枝法获得的亲水层与材料表面通过共价键连接，耐久性好，但工艺复杂，成本高，在应用上有局限性。 预吸附法是将材料或制品用水溶性聚合物溶液浸泡处理， 使聚合物在材料表面吸附形成亲水表层，从而阻抗蛋白吸附。预吸附法研究和应用的历史较短，但工艺简单、成本低，适合大规模应用，尤其适用于一次性用品，如隐性眼镜、医用导管、生化器皿等。预吸附法对大型制件和设备的表面处理也具有独特的优势。近年，聚合物自组装理论的发展促进了预吸附法抗蛋白吸附的研究。本文着重介
4、绍预吸附法的研究进展，涉及不同材料表面的预吸附机理、预吸附聚合物的结构、设计合成及预吸附和抗蛋白吸附的表征。 2吸附动力及影响因素吸附动力及影响因素 水溶性聚合物在材料表面吸附的驱动力有多种。 金属材料表面主要靠化学吸附， 如含巯基端基聚合物在金、银表面的化学结合6-7、含磷含氮聚合物在不锈钢或碳钢表面的配位络合8-9；在无机材料如玻璃、金属氧化物表面，吸附主要靠氢键和异性电荷吸引10-11；对于疏水材料，主要靠材料表面与聚合物中国化工学会（IESC）2006 年年会 中国化工学会（IESC）2006 年年会 372的疏水作用， 氢键和静电吸引也是极性疏水材料吸附聚合物的动力。 有机高分子材料
5、在所有生物医用材料中占4547， 远高于金属及无机非金属材料， 因此高分子材料表面的抗蛋白吸附改性一直是研究的重点。 蛋白在材料表面的吸附驱动力主要包括蛋白分子同材料表面之间的范德华力、静电吸引、氢键、疏水相互作用，吸附过程还受多种因素影响，如溶液温度、pH 值、离子强度、蛋白质种类及其性质等。谭国馨12考察了不同含水量的 N-乙烯吡咯烷酮(NVP)/甲基丙烯酸-羟乙酯(HEMA)共聚物水凝胶对牛血清白蛋白的吸附量与温度变化的关系。随着温度的升高，水凝胶对蛋白质分子的吸附量逐渐增大。溶液 pH 值处于蛋白质等电点时吸附量最大， 远离等电点则递减12-13。 这可能是由于蛋白质处于等电点时，静电
6、荷为零，蛋白质主要通过疏水相互作用吸附到材料表面。另外，液相电解质浓度（离子强度）较高时蛋白吸附量会因盐析效应而有所增加。 预吸附法的目标是在材料表面形成亲水性的阻隔层， 消除蛋白分子与材料表面的直接接触。 这种方法对阻抗蛋白粘附的效果取决于两方面因素， 即： 所使用的水溶性聚合物能否在材料表面形成稳定的预吸附层；预吸附聚合物对蛋白分子的排斥性能。显然，理想的聚合物应当能够从水溶液中吸附到表面形成稳定的阻隔层，而且聚合物自身具有良好生物相容性（不吸附蛋白） 。因此，预吸附法的关键是制备结构适宜的水溶性聚合物。 3用于预吸附法表面改性的聚合物用于预吸附法表面改性的聚合物 （1）非离子型水溶性均聚
7、物）非离子型水溶性均聚物 上个世纪80、90年代，曾直接使用聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)14-16、聚乙二醇(PEG)及聚氧化乙烯（PEO）17-18、葡聚糖19、聚乙烯醇（PVA）和聚乙烯基甲醚（PVME）20等水溶性聚合物实施表面预吸附。用这些均聚物预处理的蛋白分离膜（如聚砜分离膜）减少了生物垢的堵塞。PVP最初作为血浆增容剂使用。预吸附PVP的分离膜可以有效的减少牛血清白蛋白（BSA）21-22和溶菌酶（Lysozyme）23的吸附。Robinson等24研究了PVP在硅表面的吸附，发现预吸附程度由PVP的分子量决定，而不是离子强度和pH值。PVP可以阻挡硅表面75%的蛋白吸附。B
8、arrett等25详细考察了PVA在聚苯乙烯微球表面的预吸附和抗蛋白吸附，发现PVA的分子量高有利于形成较厚的预吸附层，PVA适宜的水解度是88%，而且只有当PVA完全覆盖PS表面时才能阻止人血清白蛋白（HAS）对PS的吸附，否则已吸附的PVA会被HAS取代。由于均聚物亲水性较强，预吸附层附着力偏低，形成的是不稳定的吸附层，阻抗蛋白吸附的效果不甚理想。 （2）聚电解质）聚电解质 Lee等26制备了以聚（L-赖胺酸）为主链、PEG为支链的接枝共聚物（PLL-g-PEG），该聚合物主链结构单元带正电荷。将等离子处理过的聚（二甲基硅氧烷）（PDMS，表面为负电荷）用PLL-g-PEG水溶液处理，通过
9、PLL与PDMS的静电吸引在材料表面产生PEG覆盖的涂层。蛋白吸附实验证实，经预吸附改性的PDMS具有优异的阻抗非特异性蛋白吸附性能。Jian Ji8等将阳离子聚电解质聚乙烯亚胺（PEI）吸附到不锈钢上，获得带正电荷的表面，然后再吸附带负电荷的牛血清白蛋白（BSA），形成PEI/BSA复合涂层，该涂层在pH7.35缓冲溶液中能稳定存在21天，45天后仅有不到10涂层脱落。静态中国化工学会（IESC）2006 年年会 中国化工学会（IESC）2006 年年会 373粘附实验显示，该涂层可有效抑制血小板的粘附。 （3）两亲性嵌段共聚物）两亲性嵌段共聚物 鉴于均聚物的缺点，制备具有嵌段结构的共聚物以
10、提高吸附强度成为研究重点。PEO和聚丙二醇(PPO)的二嵌段或三嵌段共聚物被广泛研究，尤以PEOPPOPEO三嵌段共聚物报道最多27。该共聚物由疏水的中段PPO提供对表面的附着力，两端的PEO链段则形成亲水表层，通过空间位阻效应阻止蛋白质分子的吸附，从而提高生物相容性。大量报道显示，预吸附了PEOPPOPEO的聚苯乙烯(PSt)微球具有显著的阻抗蛋白吸附效果28-34。 Schroen等35-36曾通过PEOPPOPEO的预吸附改善聚丙烯分离膜的抗蛋白吸附性能、降低膜组件的压降。Tan等34则研究了可用于小鼠体内注射的PEOPPOPEO预吸附的PSt纳米微球。三嵌段PEOPPO共聚物有多种商业
11、化产品，且预吸附及抗蛋白吸附性能较水溶性均聚物有显著改善。近年来，国内外研究集中在PEO、PPO链段长度及EO与PO单元的比例对预吸附及抗蛋白吸附性能的影响。研究表明，既要使共聚物形成稳定的预吸附层，又要保证抗蛋白吸附的效果，PEO与PPO链段需要控制在一个合适的比例。一部分研究者将着重点放在PEO链段上。研究发现3，短而密的PEO链段有较好的抗蛋白质吸附作用。对于长而疏的PEO链段，蛋白质可能会通过PEO层扩散并最终吸附到底物表面，因而抗蛋白质吸附作用较差。Pavey与Olliff37用表面等离子体激元共振(SPR)方法研究了不同PEO链段长度的PEO-PPO-PEO共聚物的抗蛋白质吸附作用
12、，发现将不同PEO链长共聚物的混和物预吸附到材料表面，阻抗蛋白质的效果比用单一共聚物效果好。而另一部分研究者认为PPO链段对吸附过程影响更大。Green等38-39将PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物预吸附到聚苯乙烯片材上，并用SPR方法研究了它阻抗蛋白质吸附的能力，考察不同PPO或PEO链段长度以及溶液的胶束特性对吸附作用的影响。实验结果证明，该共聚物能够吸附到苯乙烯片材上，并起到阻抗蛋白质吸附的作用，而阻抗能力的大小由共聚物与材料表面间的结合力的强度决定。这种结合力的强度取决于PPO链段长度。一方面，增加聚合物中PPO含量导致溶液中胶束对吸附的影响的减弱。另一方面，虽然PEO或PPO链段长
13、度的增加都会导致SPR角的增大，但PPO链段长度的增加使SPR角有更大幅度的增大。这些都表明，中心憎水PPO链段既是决定胶束形成的重要因素，又是溶液胶束特性对吸附影响的支配因素，从而决定了阻抗蛋白质吸附作用的效果。因此，较长的PPO链段对阻抗蛋白质吸附有利。但是过长的PPO链段将导致PPO-PEO前端共聚物不溶于水，难以用于材料表面的预吸附处理，所以文献报道的预吸附PPO-PEO共聚物中PPO链长均低于70个PO单元，使得共聚物对基材表面的附着力难以进一步提高。图1是该研究中用SPR方法将两种不同牌号的PEO-PPO-PEO共聚物吸附结果作一比较。 a为未经处理的聚苯乙烯表面， b和c分别是用
14、牌号为L31和L61的共聚物处理过的表面。L31和L61的分子量和链段组成见表1。从SPR的结果可以看到经聚合物预吸附的表面可以明显的减少白蛋白的吸附。开始时，蛋白在L31和L61表面有类似的吸附趋势，然而在实验后期，随着表面的振荡和冲洗，L61表面的蛋白被冲掉。这意味着蛋白在L61表面的吸附是不牢固的。 中国化工学会（IESC）2006 年年会 中国化工学会（IESC）2006 年年会 374图2列出了SPR方法得到的不同牌号PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物在PS表面预吸附后的蛋白吸附结果，并作一比较。从图可以看出，大部分共聚物对蛋白的阻碍作用是充分的。PEO/PPO链段的分子量对抗蛋白吸
15、附效果有影响，低分子量对抗蛋白吸附较为不利。此外，经计算，L31和L35吸附蛋白分别达到40%和25%，表明PEO链段增加而其他条件不变时，蛋白吸附量会减少。当PEO链段达到一定长度时，PPO链段长度增加、抗蛋白吸附效果改善，如P65和P103所示。这意味着共聚物在材料表面的预吸附强度也是影响其抗蛋白吸附性能的一个重要因素。改变PEO和PPO的嵌段长度比，用原子力显微镜观察预吸附表面对血浆蛋白的吸附，发现链段中PPO长度的增加，使蛋白吸附量减少。这进一步证实，是靠近亲油表面的锚式链结构而不是亲水性PEO链段的长度决定共聚物的抗蛋白吸附能力38。AFM扫描图像直观地显示预吸附P65的抗蛋白吸附效
16、能（图338），其中：a是光滑PS表面，没有缺痕。b是PS吸附白蛋白后的照片，可见颜色深浅不一，且不均匀；c是表面预吸附了P65后再经白蛋白吸附的图像，可以看到表面光滑，且无蛋白吸附的迹象。 Figure2.The SPR angle shifts (mDA) for albumin adsorption to each pluronic coating studied and to the Uncoated polystyrene surface (Green s result).38 Figure1.An SPR adsorption profile showing adsorption to the (a) uncoated polystyrene and to pluronics (b )L31- and (c) L61-coated surface ( Gr
