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1、Effect of Amino Acid Sequence Rearrangment on Prion Aggregation: Molecular Dynamics Simulations of an Amyloid-forming peptide from the Yeast Prion Sup35p Youtao Song1, *, Yanyan Ji1, Mengyuan Zhang1, Yuanyuan Yu1, Yuan Yu1, Hui Li1, and Jianwei He2, * 1) School of Life Science, Liaoning University,
2、Shenyang 110036, China (ysong ) 2) Province Key Laboratory of Animal Resource and Epidemic Disease Prevention, Shenyang 110036, China () AbstractIn order to explore the effects of amino acid sequence rearrangement on prion aggregation, 20 ns molecular dynamic simulations of 9 sequence rearranged 7-r
3、esidue peptides aligned to a 3*3*3 matrix were performed in this study. It was found that the sequence rearrangement did not affect the 7-residue peptides aggregation behavior, but changed their stabilities of aggregate complexes, especially their typical amyloid characters. Furthermore, our results
4、 suggested that the Q-N-Y sequence at the C terminal of 7-residue peptide and the N-X-Q-X-N zipper structure might be related to the aggregation rates and typical amyloid characters, respectively. Keywordsyeast prion, aggregation, sequence rearrangement, molecular dynamics simulations, 7-residue pep
5、tide 氨基酸序列重排对于朊病毒分子间聚集的影响： 酵母朊 病毒 Sup35p 氮端七肽的分子动力学模拟 宋有涛1, * 纪燕燕1 张梦媛1 于媛媛1 于元1 李辉1 何剑为2, * 1) 辽宁大学生命科学院，沈阳，中国，110036 2)辽宁省动物资源与疫病防治重点实验室，沈阳，中国，110036 摘 要 本研究利用酵母朊病毒 Sup35p 氮端七肽 GNNQQNY 作为模型，将其中间的五个残基进行乱序重排，然后利用分子动力学模拟方法研究几种重排体的聚集特性。结果表明，七肽中氨基酸序列的重排并不影响其聚集特性，但是序列重排改变了各体系中聚集体的稳定性，影响了蛋白的聚集速率，尤其是对其典型的
6、淀粉样聚集特征有所影响。实验结果暗示着七肽碳端的 Q-N-Y 序列有可能与其较快的聚集速率相关，而 N-X-Q-X-N 拉链骨架结构可能与典型的淀粉样聚集特征密切相关。 关键词 酵母朊病毒，聚集，序列重排，分子动力学模拟，七肽 1引言 朊病毒（prion）是一类能在人和动物中引起海绵状脑 病（包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁病、克雅氏病等）的病 原蛋白，其高度致死性和传染性的分子基础是朊病毒构象 转变引起的淀粉样聚集。关于朊病毒聚集机制目前有两种 主流假说：一种是序列决定论，即蛋白质一级序列的改变 会影响朊病毒的淀粉样聚集能力1；另一种是氨基酸含量 决定论，即若改变某些重要氨基酸的含量，朊病毒的淀粉
7、 样聚集能力也随之改变2, 3。 尽管两种假说都有一定的理论 国家自然科学基金项目支持（资助号：30600113, 30970125） 和实验支持，但迄今还没有一个学说可以将两者统一在一 起。 酵母朊病毒的聚集机制与哺乳动物朊病毒的聚集机制 相似4, 5，酵母PSI+表型是由酵母的翻译终止因子 Sup35p 在酵母细胞内发生淀粉样聚集所引起的6。Sup35p 由 N， M 和 C 三个结构域组成， 其中 C 结构域是酵母生长发育所 必需的功能区；M 结构域高度带电；N 结构域（1123 位 氨基酸）不保守，是酵母形成PSI+所必需的，因此也称为 朊病毒结构域，这个区域包含大量的 Q/N 序列和
8、不带电荷 的极性残基，它们对PSI+的繁殖起决定性作用7。最近的 研究表明Sup35p 的N结构域713位七肽GNNQQNY 显示了与全长 Sup35p 极其相似的淀粉样聚集的特性，是 Sup35p 聚集的核心8 ，这强烈地暗示着研究短肽的聚集 特性就可以为研究全长酵母朊病毒的聚集机制提供有力的 理论支持和指导。因此，本研究将 Sup35p 的 N 端七肽的 中间序列打乱重排，然后采用分子动力学模拟方法研究几 种重排体的聚集特性，并以 polyQ 作为阳性对照，从结构 和机制角度入手，深入探讨在氨基酸含量不变的情况下， 氨基酸序列的改变对聚集的影响。 2材料与方法 2.1 蛋白质结构来源及模型
9、构建： （1）结构模型：本实验所用 Sup35p N 端七肽 （GNNQQNY）的 X 射线衍射单体结构取自美国 RCSB 的 蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB） ，PDB 编号 1YJP9。 （2） 手动建模： 基于七肽的小分子特性和结构简单性， 我们根据 X 射线衍射得到的 Sup35p N 端七肽单体结构， 利用 pymol 软件手动构建七肽中间序列 NNQQN 乱序重排 的所有突变单体及 polyQ 七肽单体：1、GQNQNNY；2、 GNQNQNY ； 3 、 GNNQNQY ； 4 、 GQNNQNY ； 5 、 GQNNNQY ； 6 、 GNQNNQY
10、 ； 7 、 GQQNNNY ； 8 、 GNQQNNY；9、GNNNQQY；10（Q） 、QQQQQQQ。利 用 Ramachandran Plot 优化突变型蛋白单体模型。然后进一 步根据野生型及突变型单体模型构建 3*3*3 蛋白矩阵，作 为后续动力学模拟的初始模型。 2.2 聚集的分子动力学模拟 全文本模拟利用动力学模拟软件 Gromacs10和三维结 构分析与作图软件 pymol 及 VMD 进行。在该模拟体系中， 蛋白距水盒边距为 0.5 nm，单体间距离为 1 nm，各体系中 均含约 10000 个水分子，然后根据蛋白质折叠的热力学， 将各重排七肽矩阵在水溶液中进行 8 ps 的
11、能量最小化以使 其达到结构的稳定状态。模拟采用 GROMOS96 的 43a1 力 场和 SPC 水模型，模拟步长为 2 fs，体系采用限制性周期 边界条件。系统温度通过溶剂和溶质分别与参考温度的热 浴耦合来保持,温度耦合常数为 0.1 ps。系统压强通过与外 部压强浴耦合实现, 压强耦合常数为 0.5 ps。各体系温度设 置为 330 K，压力 101 KPa，PH=7， 模拟时间为 20 ns。 3结果与讨论 3.1 序列重排对体系整体结构稳定性的影响 我们将 9 种重排后的七肽（19 号）及野生型七肽（0 号） 、polyQ（10 号）构建 3*3*3 蛋白矩阵，通过 20ns 的分 F
12、ig. 1 A, The root-mean-square deviation (RMSD) of all backbone atoms of sequence rearranged 7-residue peptide corresponding to the initial structure; B, The average RMSD value of each system during simulations. 图 1. A，序列重排的七肽所有骨架原子相对应于初始结构的均方根位移；B，各体系在模拟时间内均方根位移的平均值。 子动力学模拟来研究其聚集情况。 RMSD （root mean
13、square deviation，均方根偏差）可用来测量进行比对的两个蛋白 质相同位点的氨基酸残基的碳原子之间的距离，是衡量模 拟过程中蛋白是否达到稳定结构的重要参数11。RMSD 值 越低，对应的蛋白质结构越稳定。从图 1A 中可以看出， 在 20 ns 的模拟过程中，1 号体系 RMSD 值先变大后变小 的趋势很明显，4 号体系 RMSD 值变大的趋势比较明显。 其余体系基本各自稳定在一定的范围内。提取各重排七肽 聚集的模拟过程的平均 RMSD 值（图 1B）发现，1、4、6 号重排型体系的 RMSD 值从整体上看大于其他体系的 RMSD 值，分别为 4.3905 nm、4.4728 nm
14、 和 4.3985 nm；0 号野生型体系（WT）的 RMSD 值最小，为 3.2144 nm；2、 7 号体系稍大于 WT 体系，分别为 3.4943 nm、3.5389 nm， 其余的 3、 5、 8、 9、 10 号体系处于之间 （3.63374.0733 nm） 。 这说明在模拟过程中 1、4、6 号重排型的体系整体结构稳 定性较差， 2、7 号重排型的构象变化与野生型相似，体 系整体结构比较稳定。 3.2 重排对各体系聚集速率的影响 如果一个体系发生了聚集，那么在有效距离内单体会 互相靠近，逐渐变为多单体的非结构寡聚体。我们进一步 分析了重排后的七肽及野生型七肽、polyQ 的聚集情
15、况。 结果表明，随着模拟过程不断进行，各个序列重排七肽体 Fig. 2 The number of monomers in max cluster of each sequence rearranged 7-residue peptide system as a function of simulation time. 图 2. 各序列重排的七肽体系中最大聚集体所含单体数目 Fig. 3 The average -sheet content values of each sequence rearranged 7-residue peptide system during simulation
16、s. 图 3. 各序列重排的七肽体系模拟时 -折叠结构含量的平均值 系均由最初的 27 个七肽单体的分布形式， 逐渐聚集形成一 个寡聚体，最大寡聚体所含单体肽链数量也由最初的 1 个 逐渐变为 27 个（图 2） 。有趣的是，polyQ 体系虽然在 3 ns 时聚集成为一个寡聚体，但是在 3.5 ns 时分散为两个非结 构寡聚体，并在此后到 20 ns 维持不变。在模拟过程中，尽 管所有体系都发生了聚集， 但各体系聚集的速率是不同的： 2 号、4 号体系和 0 号野生型较先形成寡聚体，聚集速率相 对较快，而 3、7 号序列体系形成寡聚体所需时间较长，其 聚集速率相对较慢。 这表明无论单体七肽的序列排列如何， 肽链氨基酸排序的改变不影响蛋白质聚集的本质，但却影 响蛋白质聚集的速率，其中 0 号野生型、2 号和 4 号都具 有的 Q-N-Y 序列有可能与其较快的聚集速率相关。 3.3 序列重排对各体系聚集过程
