转座子显示技术及其在家蚕遗传进化研究中的应用展望

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1、转座子显示技术及其在家蚕遗传 进化研究中的应用展望3韩民锦1 李 雪1 张 泽1 ,2(1.西南大学农业部蚕桑学重点开放实验室,重庆 400716;2.重庆大学农学及生命科学研究院,重庆 400030 )摘 要 转座子显示技术是研究基因组中转座子遗传进化的有力工具。家蚕基因组测序结果发现,基因组中含有大量的转座子。本文综述了转座子显示技术和家蚕基因组中转座子特点,展望转座子显示技术在家蚕遗传进化研究中的应用。关键词 转座子显示 家蚕 转座子转座子(transposon)或称转座元件(transposable elements , TEs)是基因组中依据不同的转座机制进行转座的所有移动元件1。上

2、个世纪40年代,McClintock首先在玉米中发现了转座子引起的插入突变2。转座子依据不同的转座机制,可分为两大类:一类是以RNA为介导,由于这类转座子的增殖和转座涉及逆转录过程,被称为反转录转座子(retrotransposon)或I型转座子,比如长散布因子(long interspersed nuclear elements , LINE)和短散布因子(shortinterspersed nuclear elements , SINE) ;相反,另一类是以DNA为介导,采用剪切 粘帖机制来完成自身转座,称为DNA转座子或II型转座子。DNA转座子又可分为两大类:一类是通过自身编码转座酶来

3、完成其转座的自主转座子,如Ac ;另一类是通过其它自主转座子编码转座酶来完成自身转座的非自主转座子,如Ds。近年来伴随大规模基因组测序的发展,模式生物基因组测序的结果表明,高等生物基因组含有大量的转座子。由于转座子能在其寄主的基因组中复制、 移动,因此,像其它的突变源一样,转座子不仅促进了物种间基因组的分化,而且还产生了物种内丰富的遗传多样性。利用转座子插入缺失多态性建立的分子标记技术在遗传、 基因组进化研究中的应用为我们理解高等生物基因组的进化提供了新视角。由此也应用而生出一些研究转座子遗传与进化的技术。转座子显示(Transposon Display , TD)是由Van den等3199

4、8年在扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism , AFLP)基础上改进的一项技术。它不仅可以利用高拷贝保守转座子在基因组中散布分布的特点发展新的分子标记,用于遗传连锁分析,而且还可以估计特定基因组中感兴趣转座子的数目,比较物种内不同群体以及近缘物种转座子的数目将揭示转座子的进化动力学特征,为理解基因组进化机制提供依据。转座子显示技术具有操作简单、 准确性高等特点,在水稻,玉米和拟南芥遗传进化研究中已经得到广泛应用46。家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,全基因组序列已于2004年公布7,Fujiwara等8分析家蚕基因组中转座子发现,家蚕基因组中

5、的转座子占整个基因组序列的35 %,这一比例仅低于真核生物中的玉米、 人、 小鼠和大麦。家蚕基因组中数量最多的是I型家族的转座子,尤其是非长末端重92第28卷 第4期 2008年 12月蚕 学 通 讯 Newsletter of Sericultural Science3资助项目:国家自然科学基金项目(No. 30671587) ,863计划项目(No. 2006AA10A117)。通讯作者:张泽(1963 - ) ,男,教授,博士生导师。Email : zezhang swu. edu. cn. Tel : 023 - 68251029。复反转录转座子(non2LTRs) ,短散布因子。而长

6、末端重复反转录转座子(LTR)仅占基因组中很小的一部分。II型转座子,DNA转座子也相对较少。由于家蚕基因组中富含转座子,因此对家蚕转座子的深入研究将有助于我们理解家蚕基因组的组成与进化,对家蚕遗传育种有重要理论意义。本文将简要介绍转座子显示技术并展望该技术在家蚕遗传进化研究中的应用。1 转座子显示技术转座子显示技术最早由Van den等(1998)建立并将其应用于牵牛花W138品系dTph1家族拷贝数和侧翼序列特征的研究3。该技术具体步骤如下(图1) : (1)基因组的酶切和接头的连接:一般用两个单位的限制性内切酶MseI或Bfa (依不同的转座子而定) ,在37,40l的体系下消化基因组(

7、50500ng ,依据不同的生物体而定) 3h ,然后加入一定量的双链接头和T4 DNA连接酶,在37,连接3h。(2)预选择扩增:用一对分别于接头和转座子内部互补的引物。扩增的循环和温度参数依相应的引物而定。(3)选择性扩增:设计一对巢式PCR引物,转座子内部引物用放射性或荧光标记,另一引物是接头引物+选择性碱基(A、T、C、G) ,依据不同的拷贝数选择不同个数的选择性碱基个数,一般13个碱基。(4)凝胶电泳分离及检测。这样根据转座子插入位点侧翼序列的不同而将转座子分离开来。该技术需要选择一个具有在基因组上广泛分布、 高拷贝数和高保守性的转座子以便设计转座子特异引物,这是实验成败的关键。由于

8、这项技术具有检测效率和灵敏度高的特点,因此该技术自发展以来在许多领域得到了广泛应用。图1 转座子显示流程03蚕 学 通 讯 28卷2 转座子显示技术的应用2. 1 转座子显示技术应用于分子标记遗传与变异是生物进化的基础也是生物学研究的核心问题。分子标记是以蛋白质、 核酸分子的突变为基础,检测生物遗传及其变异的一种有力工具。以上世纪50年代同工酶的发现为开端9,伴随着生命科学领域理论与技术所取得的重大突破,尤其是DNA双螺旋结构的阐明、PCR技术的诞生,使分子标记技术从蛋白质、 酶向DNA水平逐步深化,至今已衍生出几十种分子标记技术、 每一种分子标记都有其特点。目前基于转座子显示的分子标记,具有

9、以下优点: (1)利用了PCR技术的效率和特异性,还可以锁定特定的目标DNA区域进行扩增,有利于后续工作的开展(序列测定、 功能研究等)。(2)一次可检测的位点数很多。(3)数据的连续性和通用性较好,且变异的检测范围和分辨力很高。(4)技术上较简单。虽然该技术具有以上优点,但该分子标记也有显性标记的缺点。现在还没有一种分子标记能够取得理想的、 全面的效果。因此就要根据需要解决的问题选择合适的分子标记技术。Casa等52000年首先应用Hbr转座子显示技术在玉米中建立了分子标记,构建出了更为精细的连锁图谱。因为Hbr转座子具有以下适合分子标记的特点:(1)高拷贝,Hbr转座子在玉米中有3 000

10、4 000个拷贝。(2)高保守性,这3 0004 000个Hbr转座子的同源性在90 %以上。(3)广泛分布,玉米中Hbr转座子偏爱于插入到基因组低度重复序列的基因区域,这样更加适用于功能标记的开发。从分子标记发展的趋势来看,基于转座子显示的分子标记一定有更大的应用价值。2. 2 转座子显示技术应用于研究转座子的群体动力学特征转座子在各种生物基因组中占有很大的比重,了解转座子的群体动力学特征能使我们更好的了解生物体基因组的复杂度。而群体遗传学是研究转座子进化动力学的有力工具,大多数转座子群体动力学研究的焦点是转座子转座增加拷贝数和转座子有害插入的删除这一动态平衡上,但是,群体大小变化和生活史对

11、于转座子的数目和分布也起着重要作用。Lockton等62008年应用转座子显示技术分析了4个不同拟南芥群体(德国、 北美、 俄罗斯和瑞士)中的6个转座子家族( Gypsy、LINE、SINE、Ac、CACTA、MITE)的多态性,结果表明在不同的群体中转座子的数目和分布有很大的不同,并得出结论:群体大小变化的效应可能是驱动植物转座子分布的主要因素。这为我们理解高等生物基因组的进化提供了新视角。转座子显示技术除在上述两个领域得到很好应用以外,在转座子插入缺失多态性、 转座子活性鉴定及转基因插入位点的鉴定中也得到了广泛的应用1012。Takagi等132003年应用转座子显示技术分析水稻中微型反向

12、重复转座子的多态性,发现水稻属中O. sativa和O.rufipogon中的微型反向重复转座子有复杂的遗传相关性。Wessler等42006年应用该技术分析水稻中mPing元件,发现水稻在驯化过程中mPing元件发生了戏剧性的扩增。虽然转座子显示技术在这些领域得到了广泛的应用,但是目前主要的研究材料还是集中在植物,特别是玉米,因为玉米基因组含有大量(60 %)的转座子。大规模的基因组测序结果表明,除植物外,在其它物种基因组中也同样存在大量的转座子,因此转座子显示技术也一定会在其它物种中得到广泛而有效的利用。134期 韩民锦等:转座子显示技术及其在家蚕遗传进化研究中的应用展3 家蚕中的转座子家

13、蚕全基因组序列已于2004年公布。基因组拼接后总大小为432Mb ,作为转座子形式存在的序列为153 Mb占整个基因组的35. 4 %。Fujiwara等8分析家蚕基因组中转座子的分布情况(图2)。结果总共鉴定出868个转座子,数量最多的是I型家族的转座子,尤其是非长末端重复反转录转座子(non2L TRs) ,这些转座子的总长度占了基因组的13. 8 % ,短散布因子(主要是由Bm1组成,Bm2a ,Bm1b也是已知的SINE)占12. 8 %。相反,长末端重复反转录转座子仅占了基因组中很小的一部分(1. 7 %)。在家蚕基因组中,II型转座子,DNA转座子也相对较少,仅占基因组的3. 0

14、%。柱形图上面的数字代表不同转座子家族在家蚕基因组中所占的比例图2 家蚕基因组中各转座元件所占的比例家蚕基因组中转座子的比重和其它真核生物相比(图3) ,仅低于已知真核生物中的玉米、人、 小鼠和大麦,远高于昆虫中的果蝇和按蚊。图3 不同物种基因组中转座子的含量综上所述,转座子是家蚕基因组中重要的组成部分,其对于家蚕基因组组成、 进化和基因表达调控等都可能具有重要意义。所以对于转座子的深入了解将为我们提供一把了解家蚕基因组组成与进化秘密的钥匙,也必将促进家蚕遗传育种相关理论和技术的发展。23蚕 学 通 讯 28卷4 展望纵观上述转座子显示技术的发展及应用,根据技术自身和家蚕基因组的特点,转座子显

15、示技术将主要在家蚕中以下三个方面得到应用:(1)分子标记,就当前分子标记的技术现状而言,建立在DNA变异基础上的分子标记已成为技术领域的主流。其中基于转座子显示的分子标记技术由于有着良好的重复性、 准确性以及能够建立高质量、 高密度的遗传连锁图谱必将会为进一步的功能基因组学研究提供技术支持;(2)应用于研究家蚕驯化过程中转座子的插入缺失多态性。选择家蚕和野蚕作为材料进行转座子显示分析,探索特定转座子拷贝数的变化。如果转座子是有活性的,在驯化过程中就可能出现一次扩增。这样在家蚕和野蚕中就会出现转座子插入和缺失的多态性,进而可以对于家蚕的进化和起源也有进一步的了解; (3)家蚕中转座子的群体动力学

16、研究,目前家蚕主要分为,中系、 日系、 欧系和热带品系四大种群,通过转座子显示技术观察不同种群中特定转座子拷贝数的变化,可以进一步了解群体效应对于转座子进化动力的影响。除以上三个方面的应用以外,转座子显示技术可以用来鉴定转座子的活性、加速染色体步移和图位克隆,还可以对家蚕进行基因定位、 基因克隆等方面的研究有比较重要的借鉴价值。综上所述,转座子显示技术在家蚕功能基因组分析、 系统进化及生物多样性研究等方面必将具有十分广阔的应用前景。参 考 文 献1 Slotkin RK, Martienssen R. Transposable elements and the epigenetic regulation of the genomeJ . NatRev Genet , 2007 ,8 :272285.2 McC