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1、 1微粒体甘油三酯转运蛋白 MTP 的研究进展摘 要：微粒体甘油三酯转运蛋白（microsomal triglyceride transfer protein, MTP）首先是从牛肝细胞微粒体碎片中分离获得的。它的主要作用是加速甘油三酯（TG）、胆固醇酯（CE）和磷脂硫胆碱（PC）的转运和细胞或亚细胞膜的生物合成。它被认为在富含甘油三酯的脂蛋白极低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒（CM）的组装过程中扮演重要的角色。根据近几年的研究进展，本文就其结构和功能、活性、调节、多态性及其表达等方面做一综述。关键词：微粒体甘油三酯转运蛋白；活性；多态性; 表达微粒体甘油三脂转移蛋白（MTP）是一种独特的脂
2、质转移蛋白，在富含apoB（载脂蛋白B）的脂蛋白合成和分泌中起着重要作用，主要存在于内质网中，后来在肠上皮细胞的刷状缘黏膜囊泡中也分离到 MTP，MTP 通过穿梭机制催化甘油三酯(TG) 、胆固醇酯(CE)和磷脂酰胆碱在磷脂表面的转运。MTP 首先从牛肝细胞微粒体碎片中分离获得的,随后又在小肠组织分离出 MTP ,在鼠的肝脏、肠黏膜同样能分离到 TG 和胆固醇转运活性,这种活性存在于微粒体囊泡中,是继载脂蛋白B (apolipoprotein B , apoB) 之后发现参与 TG 转运及极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein , VLDL ) 组装的内质网腔
3、内蛋白,是一种重要的脂质转运蛋白。MTP 是含有大小两个亚基的异源二聚体,其主要的生理功能是将内质网外的中性脂质转运至内质网腔,参与新合成的apoB100分子脂化的第一步,进而形成新生的脂蛋白颗粒,并在调节 VLDL 组装和分泌中发挥主要作用。肝脏 MTP 的活性、基因表达状态是控制 VLDL 合成、装配和分泌速率的重要因素。因此,研究 MTP 基因结构和功能、活性、调节、多态性、表达等对预防脂肪肝,提高家畜家禽生产品质和性能有重要意义。1 MTP 的结构和功能1.1 MTP 的结构MTP 和 APOB 的N端的序列与卵黄脂蛋白有同源性。卵黄磷脂蛋白是蛋黄中主要的脂蛋白复合体,Banaszak
4、 认为其结构是由三个折叠(A、C、N) 和一个螺旋区构成。基于序列上的同样性,可以推测卵黄磷脂蛋白、MTP 和 APOB 可能在结构上相似,用2Clustal W程序检测这些蛋白之间序列的同源性(Hussain M M, et al, 2003),可以推测MTP 包含了三个折叠(A、C、N) 和一个螺旋区,APOB17 包含N和C折叠和一个螺旋区,这些结构比较表明螺旋区在三个蛋白中是最保守的,主要不同的是A折叠区,它在 MTP 和 APOB 中都缺乏,在 MTP 的M亚基中A折叠的切断可形成一个比卵黄磷脂蛋白更大的空间,这就解释了MTP比卵黄磷脂蛋能够与更多的脂分子结合,然而 APOB 包含了
5、其他疏水性的C折叠,因此暗示它能与膜关联起来。1.2 MTP 的功能1.2.1 MTP 的脂转运Wetterau等实验表明 MTP 可以通过一种穿梭机制在囊泡之间(小单层囊泡(SUV) 和 LDL 及 HDL 之间) 增加脂质的转运(Atael A and Wetterau J R, 1994)。在这种机制中 MTP 先从一个膜上提取脂肪粒,然后将其转运到另一个膜上。在提取和转运过程中, MTP 可以暂时的与供体和受体接触。据报道 MTP 在有中性电荷膜存在的时候,有最佳的脂转运活性,当膜上有负电荷时,则 MTP 的转运活性降低（Hussain M M, et al, 2003）。其动力学研究
6、表明 MTP 有两个脂的结合位点,即一个可能与脂的转运有关的快点;一个可能与膜的关联有关的慢点。另外 MTP 转运活性在脂蛋白的组装和分泌中也很重要。首先脂转运活性的缺陷与无脂蛋白血症患者血浆中载脂蛋白(APOB)是息息相关的;其次，APOB 和 MTP 在非肝细胞和非肠细胞中的协同表达,可以导致 APOB 的分泌(此细胞是不组装脂蛋白的)；最后 MTP 的抑制因子减少体外脂转运活性,从而降低 APOB 的体内分泌。1.2.2 ER内膜中的脂滴的形成和稳定化研究表明 MTP 可能将 TG 转运到内质网(endo2 plasmic reticulum , ER)内膜(叶健强，蒋立,王继文，200
7、5)。缺乏 MTP 则与 ER 内膜上脂滴的缺乏有关,抑制 MTP 的活性则会降低内膜上的 TG 的含量。同样,MTP 也可以稳定的与囊泡结合。由此,可以推测 MTP 可能对在ER中内膜上 TG 的输入和脂滴的形成和稳定化起了关键作用。1.2.3 与 APOB 结合实验表明 APOB 和 MTP 之间存在一些生理生化关系。Patel等用共免疫沉淀技术开发了一种固液交互阶段的结合实验来表明二者之间的关系,实验中 MTP 被固定起并3且用高浓度的 LDL 来温浴,然后用酶联免疫实验技术来量化和 APOB 结合起的 LDL（Mann C J, et al, 1999）。结果表明人类的 LDL 和 M
8、TP 有高度的亲和力。为鉴定在这反应中的氨基酸残基,在 LDL 上作了一些化学修饰,结果用氨基乙酸甲基脂来修饰的氨基酸残基对于 APOB 和 MTP 结合没有影响;而用乙酰乙酰辅酶A修饰的精氨酸残基可以彻底消除与 MTP 的结合。更重要的是,若是使修饰过的精氨酸残基和赖氨酸残基恢复则可以全部恢复与 MTP 的结合,这些表明赖氨酸、精氨酸残基对 APOB 与 MTP 结合是很重要的。1.3 结构和功能MTP 有三种功能和四种结构亚基,N、A、C折叠和一个螺旋区, Shoulders 研究表明不同的结构基序可能一起协同形成 MTP 的功能区域,所以推测脂转运区可能是由A和C折叠所包围,螺旋区和N折
9、叠可能包含 APOB 结合区,认为N和A折叠区可能形成膜关联区。同时有学者提出不同区域之间的功能独立性这个假设。脂转运活性的抑制因子不能影响 APOB - MTP 的结合,APOB - MTP 结合的抑制因子对 MTP 的脂转运活性不起作用,因此表明这些是功能相对独立的区域。APOB - MTP 的修饰结合是通过脂质提供依据来说明 APOB 和膜的结合, 表明 MTP 与脂质的结合可以提高 MTP - APOB 的结合,但现在还不知道是否与脂质结合作用会影响 MTP 的转运活性,这仍然需要进一步探讨和研究。2 MTP 的活性研究发现,在相同的亚细胞区域内,MTP、PDI 及 MTP 和 apo
10、B 有共同域化现象,说明 MTP、PDI 和 apoB 有相同或相似的功能（徐闯等，2004）。MTP单独表达在昆虫 sf9 细胞时,MTP 没有活性,而与 PDI 一起表达时才有活性。说明 PDI 对于 MTP 功能的实现和组成的完整是非常重要的。PDI 和 MTP 分子结合时,它的活性只有游离PDI 的1/ 10 ,而当 PDI 从 MTP 分子分离后,其活性增加。PDI 活性中心位于3540 和375384 两段氨基酸残基处。但也有报道认为,PDI 的活性在 MTP 促进 apoB 与甘油三酯的结合过程中不起作用, PDI 在 MTP 功能的实现上不发挥作用。因此, PDI 在大量超过
11、MTP 其他亚基的情况下,游离 PDI 的作用还需要研究。除 PDI 已有的酶功能外,有关 PDI 的其他功能还有待进一步研究。3 MTP 的调节43.1 细胞内毒素及细胞因子对 MTP 的调节细胞内毒素(脂多糖、LPS)和细胞因子I型白细胞介素(IL21)和肿瘤坏死因子( TNF)显著减少仓鼠肝脏 MTP mRNA 水平。这一效应只需要几小时。并且,IL21 和 IL26 显著减少 Hep G2 细胞内 MTP mRNA 水平。这一效应非常明显,在低剂量(0.1ng/ml)给药8h后效应出现。延长细胞因子对 Hep G2 细胞的处理后,MTP 活性和 MTP 大亚基水平也有所减少。IL21减
12、少了 MTP 一个增强子的表达,相应地减少了 MTP mRNA ,这说明在减少 MTP 基因表达方面,转录调节起着主要作用。MTP 启动子的敲除分析证明,上游-121到-88编码序列是 IL21 的调节位点。这个区域包括一个胰岛素响应元件(IRE) 、活化蛋白(AP21)、肝核因子I(HNF21)和肝核因子IV(HNF24)的共同序列。IRE 和 HNF24 位点的突变不影响 IL21 的作用。但是,AP21 和 HNF21 位点的突变导致 MTP 表达量的显著减少和丢失了 IL21 的效应,表明完整的 AP21 和HNF21 调节单元对于 IL21 调节 MTP 基因的表达起决定性作用。延长
13、 IL21 的作用没有改变 Hep G2 细胞内 apoB 的合成,表明 MTP mRNA 的下降不会显著地影响细胞因子介导的脂质代谢(Navasa M , et al, 1998)。3.2 胰岛素、胰高血糖素、油酸盐和葡萄糖对 MTP 的调节在 Hep G2 细胞中,胰岛素(10M)和高水平的葡萄糖(30M)减少 MTP 大亚基 mRNA 水平,胰高血糖素和油酸盐对 MTP mRNA 水平没有影响。胰岛素效应的产生是有时间和剂量的依赖性,并且受到胰岛素受体调节。另外,胰岛素也小范围减少了 PDI mRNA 水平。由于 MTP 较慢的合成率(4.4d) ,短期的胰岛素处理(24h)不改变 MT
14、P mRNA 水平,说明在 Hep G2 细胞中胰岛素调节 MTP mRNA 水平与胰岛素急性抑制 apoB 的分泌是不相关的。在 He2p G2 细胞中 MTP mRNA 水平对胰岛素非常敏感,但要想影响 MTP 蛋白的水平需要持续地改变 MTP mRNA 的水平,也就是要持续改变胰岛素的浓度。3.3 影响 MTP 的其他因素丙型肝炎病毒(HCV)核蛋白对 MTP 活性的影响。肝脏脂肪变性是HCV感染的特点之一。体内转基因模型试验证实,肝脏过量表达 HCV 核蛋白会影响 VLDL 的组装和分泌。核蛋白的表达导致 MTP 活性的降低和新合成的 VLDL 颗粒的改变,但不影响 MTP 和 PDI
15、 的生成。肝脏 apoAII 的表达减少了肝脏内核蛋白聚集和阻止 HCV 5对 VLDL 生成的作用(Perlemuter G, et al, 2002)。黄酮类化合物柑桔素和陈皮素对 MTP 的调节作用:在油酸处理的 Hep G2 细胞中,它们可减少脂酰辅酶A胆固醇脂酰转移酶和 MTP 的活性及表达从而起到对 MTP 水平的调节(Borradaile N M , et al, 2002)。4 MTP 的多态性MTP 启动子区493位点上的单碱基突变(-493G/T)，即 MTP 增强子基因的多态性能够影响 MTP 表达活性,影响血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein
16、 ,LDL)和 VLDL 水平。这种多态性通过影响核蛋白的特异性等位基因联合而调整 MTP 转录活性,影响VLDL 的合成来起作用。这一突变是发生在编码序列后的第493bp处的G/T突变,MTP 大亚基增强子的突变影响了其与脂蛋白空间构象的结合。同时这也说明 MTP 在 LDL 家族性高胆固醇血症临床症状的表现形式上起着重要的作用（孙玉成等，2005）。MTP 基因多态性也给人们提供了从基因水平上调节心血管疾病危险因素发生的可能性（黎荣山等，2005）。Stpierre J等研究发现 MTP2493G/T 多态性对冠心病的危险有深远的影响。Gambino R 等报道,MTP 基因多态性与型糖尿病患者肝脂肪变性的生物学特性明显相关,在 MTP 基因转录中G等位基因减少可造成肝内 TG 含量增加,从而说明肝脂肪变性有基因易感性(Stpierre J , et al, 2002)。5 MTP 的表达MTP 的表达主要在肝脏和小肠,此外在睾丸、卵巢、肾脏和心脏中也
