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1、四J f l 丈学博士论文节律基因m P e r i o d 2 抑制肿瘤细胞生长的体内外研究生物医学工程专业研究生：华慧指导教师：王正荣教授肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，发病率居l O 种重大疾病的第二位。虽然肿瘤的诊治取得了很多进展，但对肿瘤患者的长期疗效仍然亟待提高。动物实验和对人体肿瘤的研究均表明生物节律参与肿瘤的发生、发展。本项目立足于研究近日节律核心基因m P e r i o d 2 ( m P e r 2 ) 和肿瘤的关系。探讨节律基因m P e r 2在肿瘤细胞内过表达或低表达对肿瘤细胞生长和凋亡的影响，并深入研究其机制，进而寻求治疗肿瘤的新方向。尸B 力作为近日节律钟控系
2、统的一个必不可少的组成部分，不仅调节近日节律同时还影响器官功能。我们首先研究了P e r 2 在肿瘤细胞中高表达是否影响癌细胞生长或凋亡本研究采用脂质体介导法，将r o P e r 2 真核表达质粒p c D N A 3 1 ( + ) - m P e r 2 和空质粒p c D N A 3 1 ( + ) 转染X d , 鼠L e w i s 肺癌细胞株( L e w i sl u n gc a r c i n o m a c e l l ，L L C ) 、小鼠乳腺癌细胞株( m o u s e m a m m a r y c a r c i n o m a c e l l ， E M T
3、 6 ) 和N I H3 T 3 细胞，采用M T T 法、光镜下细胞计数绘制细胞生长曲线、细胞平板集落形成实验等方法研究m P e r 2 过表达对小鼠肿瘤细胞L L C 和E M T 6细胞增殖的作用。利用流式细胞术、基因组D N A 片断分析、H o e e h s t 3 3 3 4 2 染色和电子显微镜观察细胞形态等方法研究m P e r 2 过表达对小鼠肿瘤细胞L L C 、E M T 6 细胞和N I H3 T 3 细胞凋亡的作用。本研究证实过表达r o P e r 2 能明显抑制小鼠L e w i s 肺癌细胞株和小鼠乳腺癌细胞株的生长增殖，并能明显诱导以上肿瘤细胞凋亡，但对正
4、常细胞却无诱导凋亡作用。细胞周期检测发现r o P e r 2 过表达引起小鼠肿瘤细胞L L C 、E M T 6 细胞G l 期阻滞。r o P e r 2 过表达后，肿瘤细胞的细胞核D N A 降解。呈现典型的D N AL a d d e r 区带特征，H o e c h s t 3 3 3 4 2 染色发现凋亡细胞明显增多。电子显微镜观察到m P e r 2 过表达导致肿瘤细胞形态发生变化，细胞核染色质凝集，呈明显碎块状致密浓染。四川大学博士论文此外，为了解下调内源性m P e r 2 基因表达对肿瘤细胞凋亡的影响，我们首先用l O O n MT P A 处理L L C 细胞以诱导内源性
5、m P e r 2 基因表达，其中一组仅用T P A 处理，一组同时用T P A 和随机反义寡核苷酸，另一组用T P A 和m P e r 2 反义寡核苷酸处理。处理后2 4 小时，将细胞在血清饥饿条件下继续培养4 8 小时，然后收集细胞，固定，行流式细胞分析，检测以上三组细胞凋亡情况。另用R T - P C R 检测m P e r 2 基因表达情况与仅用T P A 处理组和T P A 联合随机反义寡核苷酸处理组相比，m P e r 2 反义寡核苷酸处理抑制了T P A 诱导的m P e r 2 基因表达。流式细胞分折表明抑制内源性m P e r 2 基因表达可显著降低血清饥饿所诱导的细胞凋亡
6、这些结果从另一个侧面证实了m P e r 2 基因促进细胞凋亡为了进一步探讨节律基因m P e r 2 过表达抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的机制，本研究采用R T - P C R 、蛋白印迹和流式细胞术等方法研究m P e r 2 过表达对小鼠L e w i s 肺癌细胞株( L L C ) 凋亡相关基因如p 5 3 ，c - M y c 、B c l - 2 ，B c I - X L和B a x 等基因m R N A 和蛋白表达的影响。R T - P C R 结果显示m P e r 2 过表达对L L C细胞c - M y c ，B c l - 2 和B c l - X L 基因的m
7、R N A 表达具明显的抑制作用，同时可增强p 5 3 和B a x 基因的m R N A 表达蛋白印迹和流式细胞术检测都显示m P e r 2 过表达可明显降低L L C 细胞c - M y c 、B c l - 2 和B c I ) ( L 的蛋白表达水平，同时明显增强p 5 3 和B a x 的蛋白表达水平这些结果表明P E R 2 的促凋亡作用是因为其增强了促凋亡的信号传导和削弱了抑制凋亡的基因。除了以上体外试验外，我们也观察了P E R 2 对L e w i s 肺癌在小鼠体内生长的影响采用小鼠L e w i s 肺癌细胞株( U C ) 于C 5 7 B L 6 小鼠右前肢腋窝皮下
8、接种，建立C 5 7 B L 6 小鼠移植瘤模型。小鼠以1 2 小时光照，1 2 小时黑暗交替( L D l 2 1 2 ) 提供光源照制2 周。随机分组，雌雄各半采用p c D N A 3 1 ( + ) 与体内转染试剂混合物、p c D N A 3 1 ( + ) m P e r 2 与体内转染试剂混合物在移植瘤内多点注射1 0 天后收集标本，采用流式细胞术检测各组移植瘤细胞的周期及凋亡率，免疫组化法分析P C N A 蛋白表达结果显示。p c D N A 3 1 ( + ) m P e r 2 组瘤重明显低于p c D N A 3 1 ( + ) 对照组，抑瘤率为5 1 7 免疫组化结果
9、提示p c D N A 3 1 ( + ) m P e r 2 组P C N A 表达明显低于对照组，差异有统计学意义( P 5 0 为。阴性对照组均用P B S 代替第抗体。结果采用图像分析软件M e d i a c yI P P 5 0 分析。结果一r o P e r 2 对L e w i s 肺癌移植瘤的抑制作用L e w i s 肺癌细胞接种于C , , B L 6 鼠，1 4 天左右形成可触及的移植瘤，实验期间无鼠死亡。瘤内注射r o p e r 2 真核表达质粒后肿瘤生长受抑制，抑瘤率为5 1 7 。图3 1 处死时各组C 5 7 B I 6 小鼠l 生理盐水对照组2 空质粒对照组
10、3m P e r 2 质粒处理组F i g I e3 1C s 7 B L 6m i c eg r o u p slt r e a t e dw i t hs a l i n eg r o u p2t r e a t e dw i t he m p t yv e c t o rg r o u p3t r e a t e dw i t hp C D N A 3 1 m P e r 2p l a s m i dg r o u p一8 0四川大学博士论文图3 2 各组C “ B U 6 小鼠移檀瘤1 生理盐水对照组2 空质粒对照组3m P e r 2 质粒处理组F i g u r e3 2C ，7
11、B L 6m i c ew a n s p l a n t a t i o nt u m o rlt r e a t e dw i t hs a l i n eg r o u p2n e a l c dw i t he m p t yv c c fg r o u p3t r e a t e dw i t hp c D N A a 1 - r o P e r 2p l a s m i dg r o u p表3 1 小鼠体重生理盐水对照组与空质粒对照组之间P 值= 0 8 8 8 ；生理盐水对照组与m P e r 2 处理组之间P 值卸2 1 7 ；空质粒对照组与r o P e r 2 处理组之问
12、P 值= 0 1 4 1裹3 2r o P e r 2 对小鼠移植瘤生长的影响分组数目肿瘤平均湿重抑瘤率P生理盐水对照组与空质粒对照组之问P 值卸5 1 0 ；生理盐水对照组与m P c r 2 处理组之间P 值四川大学博士论文锄o l ；空质粒对照组与r o P e r 2 处理组之问，值四o l ：生理盐水对照组与r o p e r 2 处理组之问抑瘤率= 4 - 5 1 空质粒对照组与r o P e r 2 处理组之间抑瘤率- - 5 1 7 Ol2345 N m n b e t e f t l m e s圈3 3 各组C ，7 B L 6 小鼠移植瘸生长曲线l 生理盐水对照组2 空质粒
13、对照组3r o P e r 2 质粒处理组F i g u r e3 3G r o w t hc i u v eo f C ，7 B L 6m i c eU t s p l a n t a t i o nt t a n m “lt r e a t e d w i t hs a l i n e g r o u p 2 t r e a t e d w i t h e m p t y v e c t o r g r o u p 3 U e a t e d w i t h p C D N A 3 1 - r o P e r 2p l a s m i dg r o u p图3 4 生理盐水对照组r o P
14、 E R 2 免疫组化F i g u r e3 4I m m u n o 陋s 的c h e m i c a Is t a h l i n gf o rr o P E R 2i nU n n o r sI r e a t e dw i t hs a l i n eo6 垂208642il鲁葺鼻-目暑葛-喜三善皇苫暑量四川大学博士论文二r o P e r 2 在肿瘤组织中的表达m P E 9 2 免疫组化显示：r o P E R 2 抗原表达于L e w i s 肺癌细胞核内和胞浆内，阳性细胞呈棕褐色染色经图像分析软件M e d i a c yI P P 5 0 分析后显示，m P e r 2质
15、粒处理组m P E R 2 阳性率明显高于生理盐水对照组和空质粒对照组( p O 0 5 ，n = 3 ) 。图3 5 空质粒对照组r o P E R 2 免疫组化F i g u r e3 5l m m t m o h i s t o c h e m i c e ls t a i n i n gf o rm P E R 2i nt u m o r st r e a t e dw i t he m p t yV e g t O g围3 6m P e r 2 处理组r o P E R 2 免疫组化F i g u r e3 6I m m u n o h i s t o c h e m i c a l
16、 鳓函I I i l 唱f o rm P E R 2i nt u m o r st r e a t e dw i t hp C D N A 3 i - r o P e r 2p l a s m i d三r o P e r 2 对移植瘤细胞增殖的影响四川大学博士论文P C I q A 免疫组化显示：P C N A 抗原表达于L e w i s 肺癌细胞核内，阳性细胞呈棕褐色染色经图像分析软件M e d i a c yI P P 5 0 分析后显示，r o p e r 2 质粒处理组P C N A 阳性率明显低于生理盐水对照组和空质粒对照组表明r o p e r 2 质粒处理组肿瘤细胞增殖受到明显抑制( p O 0 5 ，n = 3 ) 圈3 7 生理盐水对照组P C N A 免疫组化F i g u r e3 7I m m 珊1 0 I I i s t 嘣I h 锄i c
