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1、目录 一. 绪论 2 二. 细胞工程学常用设备和常用技术 3 三. 植物组织和细胞培养的基本原理 伍 四. 植物离体无性繁殖 7 五. 植物细培养与植物次生代谢产物 9 六. 植物原生质体培养与体细胞杂交 12 七. 花粉和花药培养 16 八. 植物胚胎培养 18 九. 植物种质资源的保存 19 十. 转基因植物 21 十一. 动物细胞培养 24 十二. 动物细胞融合 26 十三. 胚胎工程 29 十四. 转基因动物 31 十五. 动物染色体工程 33 十六. 干细胞技术 34 ZhangHx 细胞工程 2 . 绪论 1. 细胞工程定义：细胞工程是指按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织
2、水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程 2. 原生质体培养（protoplast culture）：指将微生物或植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，并进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。 3. 细胞融合（cell fusion）：又称细胞杂交（cell hybridization），是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。 4. 植物胚胎培养（embryo culture）：指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成正常植株的技术。 5. 动物胚胎移植（embryo transfer）：是将动物体内
3、发育的早期胚胎分离出来，将其移植到其他未受精母体子宫内，代孕产生个体的技术 6. 试管动物（tube animal） ：指利用精子和卵子的体外受精、显微受精、胚胎体外培养和移植技术所获得的各种动物 7. 克隆动物（cloned animal） ：指不经两性结合，个体不断繁殖、复制出外形、性能和基因型一致的个体。 8. 胚胎工程(embryonic engineering)：以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作，主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。 9. 干细胞工程：是动物体内具有分化潜能，并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。组织工程是在干细胞的基础上发展起来的。 Zhang
4、Hx 细胞工程 页 3 . 细胞工程学常用设备和常用技术 10. 实验室设计上最基本应该有三个室：基本操作室（准备室）；无菌操作室；培养室。 11. 植物培养基及其配制：无机元素：培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质。需要量比较多的元素叫大量元素：使用浓度一般0.5mmol/L。大量元素包括 C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S。需要量比较少的元素叫微量元素：用量一般0.5mmol/L 。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co，Cl。（其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等
5、毒害现象。） 12. 植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质： 1) 生长素类【作用：促进细胞生长和细胞分裂；诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；形成愈伤组织，促进生根；与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导】 2) 细胞分裂素【促进细胞的分裂和分化 ；诱导芽的分化 ；促进侧芽的萌发和生长 ；抑制衰老】赤霉素（GA3）【生理作用：诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效；对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用（IAA/GA 比值高有利于木质部的分化，比
6、值低有利于韧皮部的分化）；破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。；对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。】 3) 脱落酸（ABA）【生理作用：抑制蛋白质的合成；抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA 的作用；诱导休眠、促进衰老和脱落】 4) 乙烯【具有促熟果实、促进脱落和衰老、促进橡胶等次生物质的分泌、促进植物的雌花数量】 13. 分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件 ：比例高时产生芽/比例低时产生根 14. 动物细胞的营养要求复杂，需要添加血清等，常为液态 ZhangHx 细胞工程 4 1) 无机盐： NH4+：植物必须，动物有害 2) KCl、NaCl：动物培养基中含量高，植物
7、培养基中不重要 3) 微量元素：由于其他无机盐中存在有少量微量元素，可满足细胞的生长需要，因此，动物细胞培养基中无需另外添加 4) 维生素：比植物细胞需要的种类多一些 5) 激素和生长因子：植物需要一些植物激素来完成生芽生根等分化的需要。2 动物需要的生长素成分不是很明确 6) 添加剂：动物细胞常添加：去污剂、抗生素、保护剂、促贴壁蛋白 7) 指示剂：酚红(植物细胞一般情况下无需添加) ZhangHx 细胞工程 页 5 三. 植物组织和细胞培养的基本原理 15. 什么是细胞全能性？植物体的每个活细胞所具有的产生完整生物个体的能力，称之为细胞的全能性。 16. 外植体：植物组织培养中，用来进行无
8、菌培养的器官、组织、细胞和原生质体等离体材料 17. 细胞脱分化（dedifferentiation)：指已分化的细胞失去其分化特征，回复到分生组织状态，即胚性细胞的过程。 18. 愈伤组织（callus）：脱分化后的细胞，经过细胞分裂所形成的一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团。分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。（、并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。有些植物体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。2、多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的差异 ） 19. 细胞再分化（redifferentiation）：指已脱分化的
9、组织或细胞具有较大的可塑性，在特定的离体条件下，重新恢复细胞分化能力，形成各种不同类型细胞的过程。再分化过程大致分为三个时期： 1) 诱导期:又称启动期，此时期细胞由静止状态变为代谢活跃状态，细胞结构发生相应变化 2) 分裂期: 从细胞开始分裂到持续分裂 3) 分化期:愈伤组织形成到器官发生 20. 植株再生有两个途径：器官发生途径; 体细胞胚胎发生途径。 21. 胚状体：是指植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经胚胎发育所形成的胚状结构，又称为体细胞胚、不定胚或无性胚 22. 体细胞胚胎发生途径与类型 直接从器官外植体发生.愈伤组织发生悬浮培养细胞发生单倍体细胞发生原生质体发生。 23. 人
10、工种子的概念：将植物的组织培养的体细胞胚胎或芽，包埋在胶囊内形成球状结构，使其具有种子的机能，可以播种在土壤中。 ZhangHx 细胞工程 陆 24. 影响植物细胞形态发生的因素 1) 外因：培养基和环境条件：培养中培养基组成（生长调节物质：生长素和分裂素等激素。培养基中营养成分：培养基的 pH 值、渗透压、固液状态等物理性质）、温度、光照（光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应【结论：光周期的需要与否，应根据植物种类、培养的目的来决定。愈伤组织诱导阶段：一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照，器官发生阶段：一般给予周期性光照】、湿
11、度等各种环境条件都会影响 2) 内因：植物细胞的遗传性和生理状态 ZhangHx 细胞工程 页 7 四. 植物离体无性繁殖 25. 植物离体无性繁殖(propagation in vitro) ：利用离体培养技术，将来自植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体无菌培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。也称之为微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapid clone progagation 26. 植物组织离体培养的基本操作过程 1) 供体植株的准备外植体的选择外植体灭菌接种培养 2) 无菌培养物制备 ：需要合适的培养基、生长调节剂、温度、光照等 3)
12、培养物的增殖 ：不断培养使不定芽增殖、腋芽增殖、愈伤组织增殖、体细胞胚胎增殖或原球茎增殖 4) 植株再生（生根培养）：将继代增殖的小芽（苗），转移至生根培养基中，诱导根分化，最终形成根、茎、叶的完整小植株的过程。 5) 炼苗和移栽及再生植株的鉴定：试管苗的炼苗和移栽的目的就是使其逐渐从异养状态过渡到自养状态，适应外界环境。 27. 离体培养中，植物器官的发生方式（植物无性繁殖器官发生方式）： 1) 不定芽型：选取带芽的短枝进行无菌培养，诱导芽萌发成苗或增值产生不定芽发育成苗，最终经促生根发育成植株。 2) 器官型：直接从茎、叶、鳞片等外植体或带芽的休眠器官上诱导产生不定芽，再生成植株的方式 3
13、) 器官发生型：指诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根或胚状体再生成植株的方式。 4) 胚状体发生型：指植物细胞、组织和器官外植体经培养脱分化形成胚状体再生成苗的方式。 5) 原球茎型：是指外植体经培养长成原球茎，再直接产生植株的方式。 28. 试管苗的特点（弱点） 6) 形态解剖方面 ZhangHx 细胞工程 8 根： 无根毛、根与茎的输导不相连。 叶：叶的角质和蜡质层不发达。无表皮毛，保水和反光能力差。叶细胞结构疏松。叶气孔突出，张大。叶存在排水孔。 7) 生理功能方面：根的生理功能低。叶片表面极易散失水分。气孔不能关闭。叶光和能力较低，CO2 固定能力差。 29. 植物脱毒技
14、术: 1) 植物染菌特点:多数栽培植物，尤其无性繁殖植物，都易受到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染.病毒侵染的特点：20 世纪 40 年代，White 等发现病毒在根上和茎上的分布是不均匀，离根尖和茎尖越近，病毒的密度越低。反之，越高。即病毒在植物体内的分布不均匀，分生组织一般无病毒侵染 2) 加速分生组织:细胞的分裂，能够获得无病毒植株的。茎尖培养无病毒苗。 3) 脱毒方法：1 热处理脱毒.2 茎尖培养脱毒. 3.热处理与茎尖培养结合脱毒. 4.其它脱毒方式A.愈伤组织培养脱毒 B 茎尖微体嫁接 C 化学疗法脱毒 30. 脱毒苗的鉴定与保存 鉴定：1.外观判断法. 2.指示植物法. 3、嫁接
15、法. 4、抗血清鉴定法. 5、电子显微镜检查法. 6、分子检测法无毒原种的保存:试管低温保存（注意传代培养）。隔离保存将无毒植物原种种植于隔离（注意定期复查）。 ZhangHx 细胞工程 页 9 五. 植物细培养与植物次生代谢产物 31. 植物细胞培养(plant cell culture)：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术 32. 单细胞分离方法： A.由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞（叶片的最好材料） 1) 机械法（优点：不受酶的伤害，无需质壁分离。适于生理、生化等基础研究。缺点：不能普遍适用；适于薄壁组织排列疏松细胞间接触点少；产量低不易获得大量
16、活性细胞。） 2) 酶解法：【利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离的方法（常加入甘露醇等渗透压保护剂）优点：产率高。缺点：细胞易受伤害，对禾本科植物叶片的分离效果差】 B.由培养组织中分离单细胞 33. 看护培养(nurse culture)：用一块活跃生长的愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种培养方法。（优点：简便易行，效果好。缺点：不能追踪细胞的分裂、生长过程） 34. 平板培养：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在厚度为 1mm 左右的薄层固体培养基上进行培养。（优点：细胞分布均匀，便于显微观察，筛选效率高，操作简单。缺点：通气差，排泄物易积累造成毒害活影响组织吸收） 植板过程：将 1 份已调整好密度的单细胞悬浮液与 4 份 35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度为 1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm 封口膜将培养皿封严以防污染 在 25黑暗条件下培养 3 周即可长出肉眼可见的愈伤组织。 植板率
