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1、 实验十四 酵母蔗糖酶分离、 纯化、活力测定、电泳检测蔗糖酶的提取纯化 一、实验目的和要求：n了解离子交换层析的基本原理。n掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。n熟悉有关生化技术的操作方法。二、实验原理 n蔗糖酶（-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等 量的葡萄糖和果糖。因此，每水解1 mol 蔗糖， 就生成2 mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法 ，如Nelson 比色法、斐林试剂法等。n本实验用干酵母为原料，通过破碎细胞，热处理 ，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶（ invertase），并对其性质进行测定。n采用3，5-二硝基
2、水杨酸法测定还原糖含量，由 此即可得蔗糖水解的速度。n在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时 都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶 的提纯工作往往要求多种分离方法交替使用， 才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有 盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换 层析、凝胶过滤、亲和层析等。蛋白质在分离 纯化过程中易变性失活，为能获得尽可能高的 产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶 的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较 好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富 。n离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离
3、子化合物的反应主要以 离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂 的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，达到分离的目的。三、实验的主要材料市售干酵母粉四、实验的主要试剂1、石英砂（助研磨作用）。2、 95乙醇（沉淀杂蛋白）。3.、 DEAESepharose FF(弱碱性阴离子交换剂，用于蛋白质分离) 。4、 20mmol/Lp
4、H7.3Tris-HCl缓冲溶液（简称buff，用以维持蔗糖酶 液的最适pH。）5、 0.5 mol/L NaCl （调节溶液离子强度）。6、3，5-二硝基水杨酸试剂（作为还原糖显色剂）。n甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀释至 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。n乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。五、实验的主要仪器1冷冻离心机2研钵3恒温水浴箱4-20冰箱5梯度混合器6层析柱 (120cm
5、)六、实验操作流程干酵母粉加缓冲液研磨离心热处理酒 精沉淀离心上清夜上DEAESepharose FF 柱层析活力检测七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处 理一步外，尽可能低温）第一部分 样品的制备：n1.称取10.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂， 10ml buff（先量取总体积buff30 ml），在研钵内研 磨成糊状，约30分钟，再分次加buff 10ml并研磨 10分钟，, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管 ，12000r/min离心10分钟，取上清液，并量取体积 ，留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品)，用于 测定酶活力和蛋白浓度。n2.热处理 将上步所得上清液转
6、入50 ml离心管，迅 速放入50恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 1.0ml (样品)测定此酶活力和蛋白浓度。n3.酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积 的-2095乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅 慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！ ）放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上 清液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后 的沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff( 样品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 5000rpm
7、离心10min，待上样。第二部分 DEAE-Sepharose FF柱层析nDEAESepharose FF处理:（ 按说明书处理） 取适量DEAE- Sepharose Fast Flow，加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时 ，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性 ，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中 性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收 ）。浸入0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液中。nDEAE-Sepharose
8、 F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。n装柱(层析柱规格120cm)：装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体 积） 20 mmol/L Tris
9、-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理 好的DEAESepharose FF轻轻搅匀（注意不能太稀，也 不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约1-2cm后松 开层析柱出口，控制流速0.5ml/min；待柱内DEAE Sepharose FF自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水 层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的DEAE Sephadex至距层析柱上端4cm处为止（这时须保持DEAE Sepharose FF柱面平整）。用 50ml 20 mmol/L Tris- HCl、pH7.3的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进行柱 平衡，直到流
10、出液与缓冲液的pH一致。n加样，洗脱：n将平衡好的DEAESepharose FF上端的水小心吸干，留 下一薄层液面，用长滴管将样品液5 ml，沿管壁环形慢慢 加进柱内，待样品液全部进入DEAESepharose FF内， 只剩下一薄层液面时，用buff环形缓慢填满层析柱，n立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml，另一杯中装50ml buff含0.5mol/LNaCl），打开洗脱杯控制开关，开动磁力 搅拌器，用蠕动泵控制流速为3 ml/ 15min。n洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每6 min收集一管
11、(约34ml)。洗脱至混合器中液体流完为止， 比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中 ，均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液 ()测定酶活和蛋白量。(洗脱时，流速为0.5ml/分钟-1ml 分钟、4ml接收一管) n酶活力检测：n取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖（ pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺序 分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。八、注意事项：1、离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子
12、。 2、层析柱跟水平面要垂直。胶面要平，装柱时注意 操作压； 3、装柱用的树脂不能太浓也不能太稀；柱内不能有 气泡,，不能干胶，不能有断层。流速不能过快。 4、整个操作过程防止液面低于凝胶；清除管道内气 泡。 5、记录仪上zero勿动否则是一条直线。九、实验结果与分析n附：仪器调节指标 n恒流泵 流速：3ml/10minn核酸蛋白自动检测仪 A: 0.2n纪录仪 V: 20mv 走纸速度：0.5mm/minn自动收集器 6min/tube 共25tuben上样量 5mln装填平衡后的凝胶柱用肉眼观察应均匀，无纹路，无气泡。蔗糖酶活力及蛋白浓度的测定 一、实验目的和要求n掌握酶活力测定的方法；n
13、学会用Folin-酚法测定蛋白质的浓度；n熟悉酶活力蛋白浓度的计算方法。二、实验原理n蔗糖酶专一性地水解蔗糖为等量的葡萄糖和果糖。同时， 每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。本实验采用3.5 二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶 水解速度。其原理是3.5二硝基水杨酸与还原糖共热被还 原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量与 棕红色物质的颜色深浅成正比。因此可利用分光光度计进 行比色测定，求得样品中的含糖量。本法操作简便、快速 ，杂质干扰较少。n蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin 酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅 与蛋白质含成正
14、比。（Folin-酚乙试剂在碱性条件下极不 稳定，易被酚类化合物还原成蓝色化合物）。n蛋白质的Tyr和Trp还原磷钼酸磷钨酸。n干扰因素：n酚类、柠檬酸；n干扰双缩脲反应的基团；n氨基酸或肽的缓冲剂。n任何通过氮或碳原子把两个羰基连在一起的化合物都 能产生阳性结果n优缺点：n操作简便，灵敏度高，可测范围25-250微克蛋白质。n不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度 稍有不同，标准曲线也不是直线形式。n可测范围25250ug蛋白质，而紫外的范围大200 2000ug。三、实验主要材料上一实验通过离子交换获得的蔗糖酶液。四、实验主要试剂1、3，5-二硝基水杨酸试剂：n 甲液：溶解6.9g
15、 结晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀释至69ml, 在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。n 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用, 在室温放置7-10天以后使用。 2、1 g /L 葡萄糖 3、5% 蔗糖 4、250ug/mL牛血清溶液(用Tris-HCl 缓冲液配制) 5、0.2mol/L乙酸缓冲液 6、Folin-酚试剂nA液：按下列比例：4Na2CO3 : 0.2mol/L NaOH: 2酒石酸钾(钠)：1 CuSO4.5H2O=50:50:1:1(v/v)混合后一天有效。nB液：在2 L容积的磨口瓶中加入100g钨酸钠(Na2W),25g钼酸钠 (Na2MoO4.2H2O)及700ml水，50ml 85磷酸，100ml浓盐酸，充分混合，接 上回流冷凝管以小火回流10h，回流结束，加入150g硫酸锂，50ml水及数滴溴 水，开口继续沸腾15分钟，以驱除过量的溴，冷却后呈黄色(或微绿色，若呈 绿色须重复滴加溴水的步骤)，稀释至1L，使最后浓度1mol/L 酸度，过滤，滤 液置于棕色瓶中备用五、实验主要仪器n722分光光度计n恒温水浴n试管n移液管
