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1、Contents 蛋白质组学技术在动物、植物和 微生物学研究中的应用与进展 王王 瑞瑞 上海中科新生命生物科技有限公司上海中科新生命生物科技有限公司 Shanghai Applied Protein Technology Co.,Ltd 蛋白质组研究分析中心蛋白质组研究分析中心 Research Center of Proteomics Analysis 蛋白质组学概念和研究的必要性与重要性蛋白质组学概念和研究的必要性与重要性 蛋白质组学的主要研究方法和原理介绍蛋白质组学的主要研究方法和原理介绍 蛋白质组学技术在动物、植物和微生物学研究中的应蛋白质组学技术在动物、植物和微生物学研究中的应用及案
2、例分析用及案例分析 内 容 基因和蛋白质间并没有一一对应的关系基因和蛋白质间并没有一一对应的关系 基因组的直接功能注释基因组的直接功能注释 蛋白复杂的翻译后修饰蛋白复杂的翻译后修饰 蛋白的亚细胞定位蛋白的亚细胞定位 蛋白质组学研究的必要性和重要性蛋白质组学研究的必要性和重要性 一、蛋白质组学概念和研究重要性 蛋白质组学：蛋白质组学：是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究。是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究。 蛋白质组：蛋白质组：指组织或细胞中所有的蛋白质的集合指组织或细胞中所有的蛋白质的集合。蛋白质组蛋白质组 基因组基因组 与基因组学研究比较：与基因组学研究比较：将基因表达与植物代谢和
3、植物表型问题紧密联系在一起。将基因表达与植物代谢和植物表型问题紧密联系在一起。 与单个蛋白的研究比较：与单个蛋白的研究比较：在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究，对生命的复在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究，对生命的复杂活动进行全面和深入的认识。杂活动进行全面和深入的认识。 二、蛋白质组学的主要研究方法及技术路线 蛋白质组学 定性研究 大规模表达谱构建 蛋白相互作用（IP） LC MS/MS (shotgun, 复杂混合样品) 蛋白鉴定 MALDI TOF/TOF （较纯样品） 定量研究 基于凝胶技术 2-DE, DIGE 基于质谱技术 SILAC, iTRAQ, Label f
4、ree, SRM/MRM 修饰 磷酸化 糖基化 乙酰化 富集 方法 大规模蛋白鉴定大规模蛋白鉴定Shotgun Protein mixture Protein digestion SCX column fractionation Reverse column separation Auto MS/MS detection Tandem MS spectra BioWorks data base search Results 原理：基于等电点和分子量分离蛋白质原理：基于等电点和分子量分离蛋白质 技术方法和路线技术方法和路线 蛋白提取 一向等电聚焦 二向 SDS- PAGE 染色 扫描 图像分析
5、质谱鉴定 DIGE（荧光差异双向凝胶电泳）（荧光差异双向凝胶电泳） 基于凝胶技术的定量蛋白质组学基于凝胶技术的定量蛋白质组学双向凝胶电泳双向凝胶电泳 2-DE Vs DIGE 2-DE DIGE 时间和人力耗费时间和人力耗费 + + + 经济耗费经济耗费 + + + 统计分析统计分析 + + + + 多组分析多组分析 - + 动态范围动态范围 + + + 内标内标 - + 分辨率分辨率 + + + Cell or tissue Protein Peptides MS data Data analysis SILAC iTRAQ MRM Label free 蛋白提取 MudPIT或者免疫沉淀
6、酶解 质谱鉴定 技术方法和路线技术方法和路线 基于质谱技术的定量蛋白质组学基于质谱技术的定量蛋白质组学 可以更加有效的检测低丰度蛋白质和极端生化性质的蛋白质。可以更加有效的检测低丰度蛋白质和极端生化性质的蛋白质。 In vivo-SILAC Light Heavy In vitro-iTRAQ m=31 m=28 定量蛋白质组学研究技术方法的选择和比较 SILAC iTRAQ/TMT Label-free 2-DE/DIGE 样本类型 原代细胞，动物模型原代细胞，动物模型 如小鼠，果蝇，如小鼠，果蝇， 更多样品（组织，体液）更多样品（组织，体液） 更多样品（组织，更多样品（组织， 体液）体液）
7、 丰度较高的蛋白丰度较高的蛋白 （疏水性，极碱或极酸（疏水性，极碱或极酸 性蛋白不适合）性蛋白不适合） 样本需求量 + + + + + 实验规模 2 2- -3 3组（多组）组（多组） 2 2- -8 8组（多组）组（多组） 多组（依赖于质多组（依赖于质 谱重复性）谱重复性） 多组多组 鉴定数量 + + + + + 实验经费 + + + + + + 动态范围 + + + + + 三、蛋白质组学在动物、植物和微生物学研究中的应用 家畜、家禽家畜、家禽 昆虫昆虫 海洋生物海洋生物 经济作物经济作物 非经济作物非经济作物 病原微生物病原微生物 环境微生物环境微生物 工业微生物工业微生物 动物动物 植
8、物植物 微生物微生物 蛋白质组基因组帮助基因组注释蛋白质组基因组帮助基因组注释 基础研究：基础研究：细胞分化、信号转导、蛋白质折叠等细胞分化、信号转导、蛋白质折叠等。（修饰，亚细胞定位）。（修饰，亚细胞定位） A Proteogenomics帮助完成基因组注释 Agrawal GK et al. J Pro (2012) 蛋白的翻译后修饰决定蛋白的高级结构，不仅影响到其化学性质蛋白的翻译后修饰决定蛋白的高级结构，不仅影响到其化学性质, ,还对其亚细胞定位以还对其亚细胞定位以 及与其他大分子物质的相互作用倾向起到一定影响及与其他大分子物质的相互作用倾向起到一定影响, ,进而改变其活性和功能。进而
9、改变其活性和功能。研究表明，动研究表明，动 物、植物和微生物的生长、发育以及代谢调控等过程与一系列发生物、植物和微生物的生长、发育以及代谢调控等过程与一系列发生PTMsPTMs的蛋白质以及这些的蛋白质以及这些 蛋白质的作用底物有关。蛋白质的作用底物有关。 PTM 磷酸化 糖基化 甲基化 泛素化 乙酰化 B 翻译后修饰（PTM） 定量磷酸化蛋白质组学研究方法定量磷酸化蛋白质组学研究方法 Carol L. Nilsson Anal Chem (2011) 色谱分级色谱分级 磷酸化富集磷酸化富集 定量方法定量方法 质谱鉴定质谱鉴定 数据分析数据分析 TiO2 FASPFASP酶解酶解 LectinL
10、ectin富集富集 PNGasePNGase去糖基化去糖基化 Zielinska, D. F. et al. Cell (2010) 糖基化蛋白质组学研究方法糖基化蛋白质组学研究方法 I 蛋白质组学在动物学研究中的应用及案例分析 驯化、选择育种 兽医诊断、致病和耐药机制研究 药物靶标、疫苗候选抗原筛选 作为疾病研究的模式动物 （肠胃疾病、神经退行性疾病，肥胖和代谢疾病） 家禽 家畜 模式昆虫：形态、发育 非模式昆虫：生理、药剂毒理、化学生态 昆虫 环境刺激下的生理研究 免疫机理（病害） 海洋 生物 案例分析牛奶蛋白质组学 实验方法和设计：实验方法和设计：shotgun, label free,
11、 MRM 背景背景: MFGM: MFGM中富含生物活性蛋白，对其蛋白的质量和组分控制具有商业化开发价值。中富含生物活性蛋白，对其蛋白的质量和组分控制具有商业化开发价值。 实验目的：实验目的：详细的定性和定量分析详细的定性和定量分析MFGMMFGM的蛋白成分的蛋白成分，加深对加深对MFGMMFGM蛋白组分和功能的认识和蛋白组分和功能的认识和了解了解，从而更好的服务于乳制品产业从而更好的服务于乳制品产业。 Qualitative and quantitative profiling of the bovine milk fat globule membrane proteome Michael
12、Affolter et al. J. Proteomics (2010) 实验结论 通过指纹信息（特异的蛋白成分和对应的生物活性）可以快速的评价不同的牛奶蛋白成分。通过指纹信息（特异的蛋白成分和对应的生物活性）可以快速的评价不同的牛奶蛋白成分。 结合三种质谱分析方法揭示了两个结合三种质谱分析方法揭示了两个MFGMMFGM浓缩部分的蛋白组成和含量以及其可能有益健康的浓缩部分的蛋白组成和含量以及其可能有益健康的成分，对将来其营养价值的开发和应用具有重大意义。成分，对将来其营养价值的开发和应用具有重大意义。 案例分析昆虫 实验方法：实验方法：SILAC 实验设计实验设计: 两个技术重复两个技术重复
13、雌雄两组对比（鉴定雌雄性别特异性蛋白）；雌雄两组对比（鉴定雌雄性别特异性蛋白）； 野生和突变两组对比（鉴定性别特异性蛋白和体细胞蛋白）野生和突变两组对比（鉴定性别特异性蛋白和体细胞蛋白） 背景背景: : 1515N代谢标记存在问题。在此之前，多细胞生物中代谢标记存在问题。在此之前，多细胞生物中仅有小鼠模型被成功的仅有小鼠模型被成功的SILAC标记的。标记的。 实验目的实验目的: 建立果蝇建立果蝇SILAC方法方法 The SILAC Fly Allows for Accurate Protein Quantification in Vivo Matthias D. Sury et al. Mo
14、l Cell Proteomics (2010) 实验结论 建立了果蝇的建立了果蝇的SILAC方法，从而可以进行精确的体内大规模蛋白定量分析。方法，从而可以进行精确的体内大规模蛋白定量分析。 通过果蝇通过果蝇SILAC方法鉴定了新的潜在的雌雄两性特异性蛋白。方法鉴定了新的潜在的雌雄两性特异性蛋白。 第一次在蛋白水平系统的比较了雌雄果蝇的差异。第一次在蛋白水平系统的比较了雌雄果蝇的差异。 标记效率标记效率 GOGO分析性别特异性蛋白分析性别特异性蛋白 植物蛋白植物蛋白 质组学质组学 遗传遗传 发育发育 病理病理 育种育种 生理生理 II 蛋白质组学在植物学研究中的应用及案例分析 遗传多样性分析遗
15、传多样性分析 （种内和种间的遗传变异，品种鉴定）（种内和种间的遗传变异，品种鉴定） 作物改良作物改良（鉴定胁迫相关的生物标记物）（鉴定胁迫相关的生物标记物） 食品质控、安全、营养鉴定等食品质控、安全、营养鉴定等 生物生物能源能源 植物信号网络（修饰、亚细胞）和发育植物信号网络（修饰、亚细胞）和发育 应用植物蛋白质组学研究的发现成果或者技术，解决植物经济价值、食品安全、应用植物蛋白质组学研究的发现成果或者技术，解决植物经济价值、食品安全、能源可持续发展和人类健康相关的社会问题。能源可持续发展和人类健康相关的社会问题。 植物蛋白质组学发表文章数量植物蛋白质组学发表文章数量 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Number of papers Year 1. 植物信号和发育植物信号和发育 Kaufmann K., et al. Proteomics (2011) 亚细胞蛋白质组学亚细胞蛋白质组学 蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰 大规模磷酸化蛋白鉴定和分析策略大规模磷酸化蛋白鉴定和分析策略 Kline-Jonakin et al. Curr Opin Plant Biol (2011) 案例分析磷酸化蛋白质组学 Kelli G. Kline et al. PNAS (2010) In planta changes in protein phosphory
