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1、!“ 卷# 期 $%“ 年 5： .+;?8A+BA,C作者简介： 刘金林 （5： 5;AE;C5;C$%=,FO;C8-;B+ 2B+C;C+*;CA,5+FO;B+， N2*） 的生物!型外， 其余 C+KFCO8P;FAQ J5+A/FHC+A-FC;8， JKJ） ， 在世界各国均有发 生， 给全球养猪业带来巨大经济损失$。2JJ 致病因子众多， 分泌性毒素是一种主要毒 力因子， 同时也是一种重要的免疫原性蛋白， 属于L4R 毒素家族 （L+H+8O ;C 4F9;C） ， 胸膜肺炎放线杆菌 共产生 ! 种不同的 2H9 毒素， 即 2H9#、 2H9!、 2H9$和 2H9%(， !
2、。如果要产生和分泌具有生物活性的 2H9 毒素， 需要相邻的按一定顺序排列的 ! 个基因 K21* 组成的操纵子调控， 其中 2 基因编码毒素结构蛋白， K 基因编码毒素激活蛋白， 负责对毒素进行酰基化激活， 1 基因和 * 基因的翻译后蛋白产物形成跨膜通道， 负责毒素由细胞内到细胞外的分泌0。有研究表明缺失了 K 基因的菌株仍能分泌结构蛋白 2， 且具有良好的免疫原性#。目前， 猪传染性胸膜肺炎在我国乃至全球广泛流行， 给养猪业造成了巨大的经济损失。抗生素在预防和控制细菌性传染病曾起到很大作用， 但随着耐药菌株的频繁出现以及国家对抗生素使用的严格限制， 疫苗在控制猪传染性胸膜肺炎将成为主要的
3、手段。目前所使用的疫苗主要是全细菌灭活疫苗或亚单位疫苗。由于 2JJ 血清型多， 各血清型分泌的毒素差异很大， 导致各血清型之间交叉保护率较低，大大增加了防治该病的难度“。近年来， 减毒活疫苗的研究， 为该病的防治带来希望3 ) )4% 连接酶、 )4% ?+A0 酶、 /?)BC#-“,#3(,HLLLLU.(+#3HLLLE， 挑取单交换克隆子， 并用引物 3I、 3! 或 3G、 3# 进行3KM 检测， 扩增结果阳性的克隆即可判断为单交换 子。将单交换子接种不含氯霉素抗性的 GU ;? A:B$25 3FG*!(结果(“!重组转移质粒的构建 通过 9HI 从 *99 基因组中克隆到约
4、.4#J3 的#$%“A 检测时， 结果 *3Q“* 为阳性 （见图 .） ， 而 *3Q#* 为阴性 （结果未显示） ， 由此可见 #$%#( 基因的插入并没有影响 *3Q“* 的分泌及免疫学活性， 但是突变株不能分泌 *3Q#*。图 (分泌性外毒素 $)! *+*,-.% 和 /012034 5672 分析6278.+N9*SF C5 T=A=: JE;A CCEU2 ;? A-= =Q;A;Q2 *3Q“*8 *：+N9*SF CCEU2 ;? A-= B3=:CACA C$3E=； (： R=A=: JE;A CCEU2 ;?A-= B3=:CACA C$3E=8 V8 9:;A=2
5、$C:M=: T2A- E;T $;E=A:C2； .C5W8(8$*./0,$1./2,13#. $BACA A:C284OP刘金林等：血清 O 型胸膜肺炎放线杆菌 #$%“XL#$%#(Y基因缺失8L微生物学报 （.#O） WO （/）对 !“#!$ 插入位点序列分析， 发现在 !“#!$ 的 !“# 前为!$“!#“$ （%“6 7? $5 “)AB95“#!突变株对小鼠毒力试验 将不同浓度的亲本菌和突变株接种小鼠， 从小鼠存活情况看， 突变株毒力已明显下降， 结果见表 D。表 “突变株与亲本菌对小鼠毒力“AEF= DG36;F=B:= 7? 99AB9 ABC A6=B9 7B 03:
6、=H96A3BIJ(7? 03:= ;6= （:?;）K() * +)D(K * +)+(D * +)L * +)L2 * +)L M;9AB9N%OA6=B9)K%!讨论对于猪传染性胸膜肺炎的免疫防制， 目前主要依赖菌苗和亚单位疫苗， 这样虽然能对同源血清型攻击提供良好的保护， 但是， 由于 !OO 血清型众多，所有血清型均能引起猪发病， 所以仅能提供对同源血清型保护的疫苗已不能满足当前防制该传染病需要。人们从临床检测中发现自然感染并康复猪能抵抗多种其他血清型菌株的再次攻击+N， 表明活疫苗免疫可提供对异源血清型的交叉保护， 因此， 减毒活疫苗的研制已成为研究胸膜肺炎放线杆菌疫苗研究的热点。
7、减毒活疫苗除了毒力降低外， 还需要具备2 个最基本条件， 即不能回复突变， 不能将主要免疫 原性基因缺失后致使免疫原性降低， 不能将重要代谢基因缺失致使生长缓慢+K。本研究构建的突变株是将分泌性外毒素 !“#“基因的激活调节基因!“#“0 缺失， 而不影响结构基因 !“#“$ 的表达， 突变株增殖能力分析表明其生长能力并未下降， 小鼠毒力试验证明突变株毒力明显降低， 所以， 本实验构建的突变株是成功的， 基本具备了作为弱毒疫苗菌株的条件。在本次突变株构建过程中， 使用了自杀性重组质粒 PMJ$D， 它能在大肠杆菌中保持较高的拷贝数 （.$ 763） ， 但是进入到 !OO 后， 失去复制能力，
8、 只有通过同源臂整合到基因组中， 其抗性基因才能得以表达； 该质粒上带有可用于负向筛选的标记 1!23基因， 在 !OO 外膜蛋白基因 ,.)$ 启动子的驱动下表达蔗糖果聚糖酶， 蔗糖果聚糖酶通过分解蔗糖而对细菌产生毒性作用。当培养基中含有蔗糖时， 则会对相应菌株产生毒性作用， 从而达到剔除单交换子的目的。在 !OO 的四种 Q“R 毒素中， !S!具有很强的溶血活性和强细胞毒性， 因此含有 !“#!的血清型也都具有较高的毒力。本实验室贝为成等以我国流行的血清 型 !OO TU)N 为亲本菌， 构建了一株不含 抗性标记基因的弱毒疫苗菌株+L， 它对同源血清型攻击能提供完全保护， 但是对于含有毒
9、素 !“#!的强毒菌株的攻击只能提供部分保护。鉴于此， 为改造获得一株能提供更好交叉免疫保护水平的弱毒疫苗菌株， 本研究克隆了完整的 !“#!$ 的编码区， 将其整合到 !“#“$ 的激活基因 !“#“0 中， 使其丧失激活能力， 从而得到表达 !S! 的弱毒菌株。尽管 O$Q 等鉴定发现， !“#!$ 基因已经成功插入到!“#“0 位点相应， 而且通过对重组菌株上 清V=9=6B EF79 分析发现， !S“! 的表达没受到影响， 但是 !S! 蛋白却没有表达。推测其原因可能是在 !“#!$ 整合到 !“#“0 中后， 其两端仍有部分!“#“0 基因， 它们影响了 !S! 的活性以及分泌 特
10、性， 或 !“#“0 基因启动子太弱不能启动 !S!蛋白表达。目前， 本实验室正试图用 !“#!$ 基因完全取代 !“#“0 或在 !“#!$ 前添加强启动子， 以增强 !“#!$ 和 !“#“$ 的表达而不受 !“#“0 的影响。总之， 通过 O$Q、 序列分析、 稳定性分析以及小鼠毒力试验， 表明成功构建了一株胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株， 并为将突变菌株改造成多价疫苗载体进行了初步探索， 为以后研究 O$O 疫苗及 !OO 新基因功能研究奠定了基础。参考文献 + UFA:WAFF OX， YFAA=B T1， AF 7? A B=8=67=67 ?，5$，%;QQQ7刘金林等：血清 Q 型胸膜肺炎放线杆菌 ,26“:,26!“a基因缺失.微生物学报 （!;Q） 8Q （N）
