《PyroMark ID 演示》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PyroMark ID 演示（31页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Pyrosequencing Technology- PyroMarkTM ID DNA分析系统Jiabing Cao Application Department Gene Company Ltd*Biosystems head office in Uppsala, SwedenPyroMark PlatformInstrumentationReagent KitsVacuum prep workstationIdentiFire SoftwareAssay Design SoftwareSoftwarePyrosequencingTM technologyPPiATPlighttimeC
2、G TT CC A CC T N 每次向反应体系中加入一种dNTPN 相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况N 峰高与掺入的核苷酸数量成正比N 多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解PyrogramPyrogramPyrosequencingPyrosequencing焦磷酸测序技术的特点焦磷酸测序技术的特点l唯一得到定量序列结果的技术l极高的准确性lBuilt-In QCl重现性极佳l通用型技术平台l功能多样，应用领域极广l可以用于任何遗传多态性的分析l甲基化研究的最佳平台l高通量、低成本的快速临床微生物诊断l实验设计灵活l自动化程度高，操作简单lAs easy as PCR， as
3、reliable as sequencingl强大的技术支持P Pyrosequencing yrosequencing 技术的流程技术的流程PCR试样预处理， 获得单链模板PPyrosequencingyrosequencing 序列分析序列分析15 min/96 samperSQA:35 min/96 samperSNP: 10min/96 samper1-2h /96 samper结果分析C/TC/T T/TT/T实验设计PCR Reaction PCR产物长度，最好在200bp以内 PCR Primer之一标记生物素，使用HPLC纯的生物 素标记引物 生物素标记的引物量不要过多（10p
4、mol in 50uL PCR reaction） ，否则会干扰结果 50uL体系，做50个循环，一般建议10ng Genomic DNA 可以在agarose胶上检测PCR产物，需要得到单一 、较强的条带分离纯化单链设备Vacuum Prep Workstation真空泵废液缸工作台配有真空计真空开关五个水槽位置两个反应板位置Vacuum Prep ToolFilter probes re-usable at least 100 times分离纯化单链准备试剂在使用前让所有试剂达 到室温第一次使用kit时，使用 18.2M纯水溶解酶和 底物，延瓶内壁缓缓加 入水，轻轻摇晃使其溶 解，不要剧烈
5、，尽量避 免产生气泡试剂舱若长期未使用， 请重新清洗，并待完全 干燥后再使用试剂存放把试剂加入试剂舱 根据每次实验的样品，按软件给出的需要试 剂的体积分别加入到试剂舱中，加入试剂时 注意：把试剂舱的标签面对自己，按下图所 示的孔位置加入，千万不能加错位置。The reagents in CartridgePyrosequencing 测序反应 打开仪器，仪器需要预热90min，所以应早点打开 打开电脑和软件 设定SNP entry，设定的是所分析的序列信息（ SNP Simples Entries New Entry ) 设定SNP Run，设定本次反应的信息，如反应孔以 及反应每孔的样品（S
6、NP SNP Run New SNP Run) 把经过试样预处理的PSQ96板放置在仪器上，把加 好试剂的试剂舱放置在仪器上，试剂舱放置时应把 有标签的一面对外 测序反应PyroMarkTM ID SNP softwareSNP Entry 用户建立SNP/突 变序列数据库 输入待分析的序列 ，如： A/GGGCAGATC CTTG. 软件自动计算各种 基因型的理论结果Set up a runDuring the runQuality assessed dataAfter run 立即清洗试剂舱，清洗得当的情况下，可以 重复使用20次，在试剂舱标出使用的次数 如果两周以上不会再使用仪器的话，则
7、关闭 仪器，否则的话，使仪器保持打开状态（关 机时注意：先通过软件关机，再关闭仪器上 的电源） 退出PyroMarkTM ID软件 如实验中有液体溅出，请清洁仪器Thanks a lot!Jiabing Cao Application Department Gene Company Ltd*PyrosequencingIn Combination with QPCRGeneral Bacterial typingGenus specific classificationSpecies specific assaysGeneral Fungal typingSub-Species specifi
8、c assaysViral typingAntibiotic resistancePyrosequencingPyrosequencing在微生物领域的应用在微生物领域的应用Conventional Conventional vsvs Molecular methods Molecular methodsL传统方法表型测试 需要培养 耗时长 受环境的影响，变数多 判断困难，有时需倚仗经验，有主观性 有一些微生物培养上很复杂，难以鉴定J分子方法无需培养快速准确即便是死样本也可以进行分型PyroMarkPyroMark ID ID：ApproachApproachN确定研究对象及相关种群N寻找特征
9、 差异基因F16S rRNA, 18S, 23SFrnpBFrpoBFinlBNAssay Design Software：在目标基因的保守区设计PCR及测序引物N焦磷酸法测定可变区序列NIdentiFire Software：与数据库比对，确定分型结果WorkflowWorkflowDNA制备样品收集/培养鉴定与分型结果PCR扩增单链模板制备Pyrosequencing数据库搜索/结果比对15 min40 min1 min/sample10 min30 min 2 hrs细菌综合分型细菌综合分型N16S rRNA gene是细菌分型中使用最为广泛的 目标基因N对16S rRNA gene可变
10、区V1和V3进行扩增后 用焦磷酸法测序NPCR 及测序引物则设计在两侧的保守区中属内相似种的鉴定属内相似种的鉴定分支杆菌由于其生长缓慢,以及许多品种间表型 相似，常规表型鉴定的手段很难来鉴定其中许 多种。16S rRNA & rnpB gene used for typingrpoB gene used for Rifampicin resistance analysis微生物抗药性分析微生物抗药性分析Rifampicin（利福平）mutations in the rpoB geneIsoniazide（异烟肼）mutations in the katG geneFluoroquinolone
11、s（对苯二酚）gyrALinezolide(利奈锉氨 ) resistance mutations in 23SEthambutol （乙胺丁醇）embB病毒鉴定及分型病毒鉴定及分型 Human papilloma virus人的乳头状瘤病毒，某些亚型与宫颈癌的发生相关 Hepatitis C virus HIV-1 typing Polyomavirus 多瘤病毒 Rotaviruses轮状病毒，引起新生儿肠胃炎 Respiratory Syncytial Virus呼吸道合胞病毒，引发新生儿细支气管炎Thanks a lot!Jiabing Cao Application Department Gene Company Ltd*
