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1、胎盘组织荧光胎盘组织荧光 PCRPCR 诊断早诊断早 期先天梅毒的研究期先天梅毒的研究【关键词】 先天梅毒摘要:目的 评价胎盘组织荧光 PCR（FQ-PCR）在先天梅毒早期诊断中的作用。 方法 对 34 例梅毒孕妇和 30 例非梅毒对照孕妇的胎盘和脐带组织进行梅毒螺旋体 DNA 的荧光定量 PCR 检测，并与常规临床及血清学综合诊断方法比较。 结果 34 例梅毒孕妇的胎盘组织中，11 例荧光 PCR 为阳性，阳性率为 32.35%，30例非梅毒孕妇的胎盘和脐带样本荧光 PCR 均为阴性;以常规临床及血清学综合诊断方法为标准，则荧光 PCR 与常规方法结果的灵敏度为 82%，特异性 100%，约
2、登指数 0.82。显示在诊断先天梅毒新生儿时，FQ-PCR 至少有不低于常规综合诊断方法的价值。结论 与常规临床血清学综合诊断方法相比，荧光 PCR 均有明显的优势。 关键词:先天梅毒;FQ-PCR;诊断Study on detection of placental Treponema pallidum DNA for diagnosis of congenital syphilis by using FQ-PCR.PENG Shi-qian，ZHOU Hua，ZHANG Rong，et al.（Baoan District of Shenzhen Municipal of Chronic D
3、iseases Control and Prevention，Shenzhen518133，Guangdong，P.R.China） Abstract:Objective To evaluate the role of FQ-PCR in detection of placental Treponema pallidumDNA for diagnosis of con-genital syphilis. Methods Thirty-four placental specimens from pregnant women with syphilis and thirty specimens f
4、rom health pregnant women were blindly evaluated with:（1）FQ-PCR for placental Treponema pallidumDNA;（2）Traditional comprehensive approach for diagnosis of congenital syphilis.The results were compared with each other. Results Among the34placentas from syphilitic women who completed pregnancy，11had p
5、ositive FQ-PCR.None of the30infants from health mother had positive result.FQ-PCR for placental Treponema pallidum DNA showed comparable sensitivity superior to the traditional comprehensive approach for diagnosis of congenital syphilis. Conclusion FQ-PCR for placental Treponema pallidum DNA could b
6、e an addition to conven-tional diagnostic tools. Key words:Congenital syphilis;FQ-PCR;Diagnosis 20 世纪 80 年代以来，随着梅毒在我国的再度流行，先天梅毒的发生率迅速增加。先天梅毒可引起多器官严重损害，患儿出生后数周即可出现全身皮疹，心、肺、肝、肾等器官损害，甚或死亡 1 。但是，先天梅毒早期诊断主要是依靠传统的血清学诊断方法，存在明显不足，无法满足临床需要。因此，敏感和特异的先天梅毒早期诊断方法的探讨成为当今梅毒学研究的重要内容之一。近来，国内进行了一些相关研究，但有关荧光定量 PCR（FQ-
7、PCR）技术在先天梅毒诊断中的应用相关报道很少。为此，我们应用 FQ-PCR 技术对 34 例梅毒孕妇分娩或引产时的胎盘和脐带组织中的 TP-DNA 进行了检测，并与目前广泛使用的诊断先天梅毒的临床及血清学综合诊断方法进行比较。1 材料与方法 1.1 研究对象 2002 年 7 月2004 年 12 月，由深圳市、区各医院产科转诊到深圳市慢性病防治院或宝安区慢性病防治院的 34例梅毒血清学筛查试验阳性，符合中国卫生部颁（2000 年）性病诊疗规范和推荐治疗方案-梅毒诊断标准和治疗规范中诊断标准，并完成妊娠或选择引产者;另选择 30 例梅毒血清学筛查试验阴性的同期产妇或引产妇为正常对照。要求所有
8、参加研究者，全部签署知情同意书。 1.2 样本的收集和检测 由专人在严格无菌操作的情况下，取引产的新鲜全层胎盘和脐带，放入无菌的带盖塑料瓶中，-20低温保存（保存时间小于 3 个月） 。两组标本采用盲法检测。并在分娩后，立即抽取母亲和新生儿静脉血。 1.3 研究方法 梅毒螺旋体 FQ-PCR 试剂盒由深圳匹基公司提供生产，BioRAD icycler 荧光 PCR 检测仪;RPR 试剂上海荣盛生物技术有限公司生产;TPPA 试剂由日本富士瑞必欧株式会社（FUJIREBIO INC，TOKYO）生产;FTA-ABS-19S-IgM 试剂盒德国欧蒙医学实验室诊断试剂有限公司（EUROMMUN）生产
9、。上述实验都严格按试剂盒说明书操作并判读结果。1.4 先天梅毒诊断标准 参照美国疾病控制中心 1988 年修订先天梅毒的诊断标准中出现下列情况之一者诊断为先天梅毒 2 :（1）母亲梅毒非螺旋体及螺旋体血清试验阳性，新生儿出现早期先天梅毒的典型临床表现;（2）母亲和新生儿非螺旋体及螺旋体血清学试验阳性，分娩时新生儿非螺旋体血清学试验滴度大于或等于母亲之滴度;（3）分娩时新生儿和母亲的非螺旋体与螺旋体血清学试验均为阳性，新生儿 FTA-ABS-19S-IgM 阳性;（4）母亲非螺旋体及螺旋体血清学试验阳性，新生儿 FTA-ABS-19S-IgM 阳性。2 结果 2.1 一般资料 病例组 34 例符
10、合纳入标准的梅毒孕妇完成了整个研究过程。其中，29 例孕妇接受了正规的驱梅治疗，5 例孕妇未治疗或治疗不充分（已行治疗，但疗程不足或未按照标准治疗均为治疗不充分）;对照组 30 例梅毒血清学检查为阴性的孕妇中，年龄最小 21 岁，最大 30 岁，平均年龄 24.86 岁。均完成妊娠。64 名新生儿中，男 34 例，女 30 例;胎龄2500g45 例。所有新生儿中，仅 3 例有与先天梅毒一致的临床表现。 2.2 胎盘及组织的 FQ-PCR 检测 64 份标本中，按常规临床血清学先天梅毒诊断标准，诊断 9 例为先天梅毒，其中确诊 1 例，拟诊 8 例。以荧光 PCR 检测 11 例为阳性，全部来
11、自病例组。30例非梅毒孕妇的胎盘和脐带样本各项检查均为阴性。 34 例梅毒患者 FQ-PCR 检测结果与常规临床血清学综合诊断方法结果见表 1。 表 1 34 例梅毒患者 FQ-PCR 与常规检查结果比较（略）Table1 Comparing results in detection of34syhilis casesby FQ-PCR and conventional methodFQ-PCR*常规临床血清学诊断方法包括结合临床症状，母/婴 RPR 滴度和 FTA-ABS-19S-IgM。参照美国疾病控制中心推荐的先天梅毒诊断标准。结果 FQ-PCR 与常规检查的结果差异无显著性。表明两种方
12、法间有较好的一致性（Kappa 值0.6） 。如果以常规临床血清学综合诊断方法为标准，则 FQ-PCR 与常规检查结果的灵敏度为 82%，特异性100%，约登指数 0.82。 3 讨论 先天梅毒早期诊断主要的困难在于，确诊必须检查到苍白梅毒螺旋体。但梅毒螺旋体的体外培养的问题始终没有得到解决，尽管兔感染试验（RIT）可以确诊，但费用高昂而且费时极长，无法应用于临床。 近年来，聚合酶链技术得到了长足的发展，引起了相关学者的关注。研究证实，聚合酶链技术可检出 0.01pg 的纯化抗原，只要各种临床组织或体液中存在 1 条梅毒螺旋体既可检出 3 。Grimprel 4 和 Sanchez 等 5 证
13、明 PCR 检查新生儿血清和脑脊液的结果，与 RIT 有高度相关性，而且对先天梅毒的诊断可以有 74%的敏感性和 96%的特异性。但 PCR 的运用中，样本的来源尚存在争议;Konrad Wicher 等以感染梅毒的兔为动物模式验证 PCR 各种样本的价值，认为全血、新鲜或冷冻组织样本均有理想的结果，而血清不适合进行 PCR 检查 6 。Jennifer M 等的研究则认为，损伤部位的分泌物，血清，脑脊液，羊水和组织为样本均可用于 PCR 检测梅毒螺旋体 7 。尽管存在争议，但 PCR 在先天梅毒的诊断中具极高的价值已是公认的事实。 常规 PCR 方法存在较大的缺陷。1996 年，由美国 Ap
14、plied Biosystems 公司推出的实时荧光定量 PCR 技术，弥补了常规PCR 易产生假阳性和不能定量两大技术缺陷。与竞争性PCR、PCR-EILA 等定量 PCR 相比 8 ，荧光定量 PCR 除了有快速、操作简便，还不需对 PCR 产物进行后处理，从而防止了扩增产物污染等优点外，具有定量范围宽、定量准确等优点。理论上，荧光定量 PCR 可用于先天梅毒的诊断。国内蔡兰、何世全、李建民和段逸群 912 等先后将 PCR 和荧光定量PCR 技术用于其它各型梅毒的诊断，认为良好的特异性使其在梅毒和其它螺旋体病的鉴别诊断、梅毒螺旋体的病原学研究等方面具有重要作用。此外，合并 HIV 感染的
15、梅毒病人血清学试验常呈阴性，此时用 PCR 检测脑脊液中是否存在梅毒螺旋体是证实其感染的唯一方法。但是，国内尚未见将荧光定量 PCR 用于先天梅毒诊断的报道。 为此，本次在研究中采用了荧光定量 PCR 技术来检出胎盘组织中的梅毒螺旋体的 DNA。以探讨荧光定量 PCR 技术在先天梅毒诊断中的价值。结果与常规血清临床综合综合诊断方法进行比较，通过统计分析显示:P0.05（McNemars 检验） ，尚不能认为 FQ-PCR 与综合诊断方法的结果差异有显著性。显示两种方法间有较好的一致性（Kappa 值0.6） 。如果以常规血清临床综合诊断为标准，则 FQ-PCR 与常规检查结果的灵敏度为 82%
16、，特异性 100%，约登指数 0.82。显示在诊断先天梅毒新生儿时，荧光定量 PCR 至少有不低于综合常规诊断方法的价值。而优于临床症状，母/婴 RPR 滴度之比和 FTA-ABS-19S-IgM 三种常规诊断方法中的任何一种，这对于提高先天梅毒的检出率，减少漏诊的发生，有积极的意义。本研究 2 例荧光定量 PCR 检查阳性，而出生时通过常规诊断无法确诊的新生儿，并不能排除先天梅毒诊断，因为有研究证明:即使感染了梅毒螺旋体，宿主亦可表现为血清学试验阴性 13 。此 2 病例也应列为先天梅毒危险病例予以正规驱梅治疗，并追踪观察。而且，本试验中，30 例梅毒血清学试验阴性孕妇胎盘和脐带组织的荧光定量 PCR 检查结果均为阴性，显示荧光定量 PCR 技术也有较好的特异性。 尽管荧光定量 PCR 技术检测梅毒螺旋体 NDA 的敏感性高，在试验中仅检测了相对较少的组织，而胎盘和脐带组织中梅毒螺旋体的数量又极少 14 ，因此，也存在遗漏的可能。需要扩大试验，进一步证实其在先天梅毒诊断中的价值。 综上所述，荧光定量 PCR 技术敏感，特
